通心络对2型糖尿病肾病大鼠纤溶调节因子PAI-1表达的影响

邹大威 高彦彬 李娇阳 周盛楠 张娜 吴晓明 田年秀 王晓磊 朱智耀

最新发表于《美国医学会杂志》(JAMA)的一项研究显示，2013年中国大陆成年人糖尿病的总患病率约为10.9%，糖尿病前期的患病率为35.7%[1]。2型糖尿病并发肾病的患病率为34.7%[2]，也是糖尿病患者致死致残的主要原因。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最主要的微血管并发症，糖尿病患者血液处于高凝高粘状态，由于血液黏度增高，血流缓慢，组织血液灌注量减少，致使组织缺血缺氧，局部代谢产物蓄积，导致肾内微循环障碍。本研究在络病学说指导下，基于中医学“同病异治”理论，旨在探讨通心络对2型糖尿病肾病肾内微循环、肾脏病理及肾功能的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

8周龄SPF级雄性SD大鼠30只，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 干预药物与试剂

链脲佐菌素(streptozocin，STZ)，通心络超微粉(主药为人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍等，由河北以岭医药研究院有限公司提供)，链脲佐菌素(美国，sigma)，大鼠组织型纤溶酶原激活物Elisa试剂盒(CSB-E07917r，武汉华美)，大鼠纤溶酶原激活物抑制因子(CSB-E07948r，武汉华美)。

1.3 仪器

CareSens POP血糖仪(爱科来国际商贸有限公司)，自动血液流变仪(LBY-N6K，北京普利生仪器有限公司)，毛细血管黏度针(LBY-NW1，北京普利生仪器有限公司)，血凝仪(C2000-4，北京普利生仪器有限公司)，毛细管离心机(KH-120M，日本)，台式离心机(TGL-16，上海安亭科学仪器厂)，血小板聚集仪(LBY-NJ4，北京普利生仪器有限公司)，卓越320、330全自动生化分析仪(上海科华实验系统有限公司)。

1.4 实验方案

本实验采用高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素建立2型DN 大鼠模型，随机选取SD大鼠10只为空白组，其余20只大鼠予以高脂饲料饲养4周后，禁食12小时，按照35 mg/kg体重一次性腹腔注射1%的链脲佐菌素，72小时后大鼠尾静脉取血测血糖，空腹血糖(fasting blood glucoce，FBG)≥16.7 mmol/L视为糖尿病模型建立成功。造模成功的SD大鼠随机分为模型组(10只，等量蒸馏水灌胃)，通心络组[10只，生药0.4 g/(kg·d)灌胃]；空白组(10只，等量蒸馏水灌胃)，实验期间自由进食饮水，连续给药16周。

1.5 标本收集及指标检测

给药16周末，各组大鼠尾静脉取血测定血糖。禁食12小时后，次日清晨末次给药后以10%的水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g)，腹主动脉取血，部分血样用3.8%的枸橼酸钠抗凝，抗凝全血用于血小板、全血黏度的测定；部分血样3000 r/min离心15分钟以分离血浆，用于血浆黏度和血浆纤维蛋白质含量的测定。部分血样不抗凝静置2小时后分离血清测定肌酐、血清尿素氮及纤溶调节因子测定。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 通心络对2型DN大鼠血糖、体重、肾功能的影响

如表1所示，与空白组相比，模型组大鼠的血糖明显升高(P>0.05)、体重(body weight，BW)明显降低(P<0.05)，通心络能升高2型DN大鼠体重，但对血糖没有影响(P>0.05)。与空白组相比，模型组大鼠的血肌酐、血尿素氮明显升高(P<0.05)；通心络给药16周能够降低DN大鼠血肌酐、 血尿素氮(P<0.05)，提示通心络能够保护2型DN大鼠肾功能。

表1 通心络对2型DN大鼠血糖、体重及肾功能的影响

注： 与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

表2 通心络对2型DN大鼠血液流变学的影响

注： 与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

2.2 通心络对2型DN大鼠血液流变学的影响

如表2所示，与空白组相比，糖尿病大鼠高、低切变率下的全血黏度、血浆黏度、血浆纤维蛋白原含量、血小板聚集率均明显升高(P<0.05)。与模型组相比，通心络干预降低上述血流变指标(P<0.05)， 提示通心络可通过改变血液流变学特性，降低血液的高凝状态，增加肾组织的血液供应，改善肾内微循环。

2.3 通心络对2型DN大鼠纤溶调节因子t-PA及PAI-1表达的影响

如表3所示，与空白组相比，模型组血浆组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogenemia activator, t-PA)降低，血浆纤溶酶原抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)增高；与模型组相比，给药16周时通心络组的血浆T-PA表达有升高的趋势(P>0.05)，PAI-1明显降低(P<0.05)。提示通心络可通过降低血浆PAI-1水平，改善DN晚期大鼠纤溶活性，增加肾组织的血液供应，改善肾内微循环。

表3 通心络对2型DN大鼠纤溶调节因子t-PA、PAI-1表达的影响

注： 与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

2.4 通心络对2型DN大鼠肾组织超微结构的影响

透射电镜观察可见：空白组肾小球、肾小管及肾间质结构清楚，肾小球基底膜均匀一致，足突排列整齐清晰，细胞外基质区大小及系膜细胞数量正常；模型组：肾小球基底膜节段性不规则增厚，足突变形、低平甚至脱落，系膜基质区扩大，系膜细胞增多，肾间质区可见纤维化表现。通心络组较模型组的病理变化程度有所减轻。见图1。

3 讨论

本实验采用高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素注射建立2型DN动物模型，DN以肾小球硬化及肾间质纤维化为主要病理特征，临床表现为尿蛋白增多及肾功能进行性恶化，本实验表明通心络具有保护肾功能、改善肾脏病理的作用。

DN是糖尿病最常见的微血管并发症，是导致终末期肾病的主要原因之一。目前认为，DN会引起血管内皮细胞结构及功能损伤，导致内皮细胞源性血管活性因子表达失调、血管舒缩功能失调、抗凝功能降低，纤溶活性下降。血液流变学是反映血液循环的重要指标，其变化反映血液黏滞性及凝固性的改变[3]。本实验表明DN动物模型的全血黏度、血浆黏度、血小板聚集率以及纤维蛋白原均明显增加，血液处于高粘高凝状态；通心络干预可增加肾脏血流，改善DN大鼠肾内微循环。tPA和PAI-1是纤溶系统中非常关键的一对活性物质，tPA是纤溶酶源激活剂，而PAI-1是丝氨酸蛋白酶抑制剂，可迅速与tPA结合使其失去活性，抑制纤溶酶原转化为纤溶酶，抑制血浆纤溶活性。另外，纤溶酶减少可抑制细胞外基质的降解，促进细胞外基质积聚，进一步加重肾小球硬化和肾间质纤维化[4]。本研究显示通心络能够减少血浆PAI-1含量，增强纤溶活性，减轻DN大鼠肾纤维化，延缓DN进展。

DN临床发病呈进行性进展，迁延难愈，易滞易瘀，与络脉的结构运行及功能、发病特点相一致。吴以岭院士[5]认为糖尿病肾病病机是气阴两虚、阴虚燥热、阴阳两虚，消渴的早期是肺燥、胃热多见，后期为肾虚，并继发他脏病变，影响气、血、水的运行，导致气滞、血瘀、水停为病，邪阻于肾络，则肾络不畅，从而产生络脉郁滞、络脉瘀阻、络脉瘀塞、络息成积等主要病理变化。本病属于“久病入络”“久病多瘀”，可归属于“络病”范畴。瘀血内阻是糖尿病肾病的基本病理改变，病在络脉是糖尿病肾病的中心环节。通心络是吴院士在络病理论指导下研发的中药复方，主要成分包括人参、水蛭、全蝎、赤芍、蝉蜕、土鳖虫、蜈蚣、檀香、降香、乳香、酸枣仁、冰片等十二味中药，全方有益气通络、活血化瘀之效。人参为君药，气旺则血行，肾络通畅，水蛭入络活血、全蝎搜风通络止痉共为臣药；佐以蝉蜕、土鳖虫、蜈蚣等通络虫类药收活血温通，通络止痉之功，冰片为使药。临床研究表明，通心络能够降低DN患者尿蛋白、保护肾功能，改善血流变特性[6-7]。中药药理研究表明人参具有抗纤维化的作用，全蝎、赤芍、水蛭具有抗凝、抗血栓、促纤溶、抑制血小板聚集的作用[8-10]；土鳖虫、降香具有抗凝血作用[11-12]。通心络能够改善DN大鼠血液高凝高粘状态，这与其他活血通络复方的研究是一致的[13-15]。络病是冠心病及糖尿病微血管并发症等重大疾病的共性病理基础。通心络治疗冠心病疗效确切，同时能够降低DN大鼠尿蛋白、保护肾功能，其对心、肾的共同保护作用体现了中医“异病同治”的大法[16]。

综上，通心络具有抗凝、降纤的作用，可降低血液的高凝高黏状态，改善肾脏局部微循环灌注，改善DN大鼠肾脏病理及保护肾功能，延缓DN进展。

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