肝纤维化几种病理染色方法及意义归纳*

徐艳华 金 刚 巴图德力根 苏日古嘎 孙德志

1.内蒙古民族大学附属医院 (内蒙古 通辽，028007)2.内蒙古呼伦贝尔市新巴尔虎右旗结核病防治所

肝纤维化是慢性肝炎发展至肝硬化的早期可逆阶段。目前，组织病理检查是诊断肝纤维化的金指标[1]。肝纤维化相关病理切片染色方法多样，根据各种染色的着色部位不同，其观察重点各异。本研究通过建立肝纤维化模型，肝组织取材，对HE染色、弹力胶原纤维染色、网状纤维染色、Masson(马松)三色染色、天狼星红染色等染色方法进行比对研究，探讨各种染色在肝纤维化组织病理诊断中的特殊意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠16只，吉林大学实验动物中心提供，体重180～220g。动物质量合格证号SCXK(吉)-2013-0002。颗粒饲料购自吉林大学实验动物中心。纯净水购自通辽市康乐纯净水公司。

1.1.2 试剂 苏木精、伊红、氨水、丽春红、维多利亚蓝B、苦味酸、硫酸铁铵、高锰酸钾、草酸、硫代硫酸钠、硝酸银、氢氧化钠、氯化金、天狼星红、天青石蓝B、酸性品红、甘油、中性树胶、无水乙醇等，均为国产试剂(分析纯)。

1.1.3 仪器 EG1150H包埋机、RM2235切片机(德国Leica公司)；DM2500光学显微镜(含偏光镜)(Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝纤维化模型建立[2]Wistar雄性大鼠16只，分为正常对照组8只和模型组8只。模型组大鼠腹腔注射30%CCl4橄榄油溶液1次/4天，注射剂量2.0ml/kg (注射剂量/大鼠体重)，连续7次，建立肝纤维化模型。于第7次造模后48h处死大鼠取肝组织固定于10%中性福尔马林中4h取出，常规乙醇逐级脱水、二甲苯透明、浸石蜡缸Ⅰ和Ⅱ、石蜡包埋；连续切片(厚度4um)、摊片、烤片、烘片，常规二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗。

1.2.2 肝组织切片进行HE染色 二甲苯Ⅰ脱蜡15min-二甲苯Ⅱ脱蜡15min-100%乙醇吸取二甲苯10min-95%乙醇2min-90%乙醇2min-85%乙醇2min-蒸馏水洗2min-苏木精染色5min-自来水冲洗1min-1%盐酸酒精分化(提插数下)-自来水冲洗1min-伊红染色3min-自来水洗30s-95%乙醇Ⅰ 1min-95%乙醇Ⅱ 1min-100%乙醇Ⅰ 1min-100%乙醇Ⅱ 1min-二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-中性树脂封固。观察肝细胞变性、坏死、炎细胞浸润等，评分并分级。

1.2.3 肝组织切片进行弹力胶原纤维染色 二甲苯Ⅰ脱蜡15min-二甲苯Ⅱ脱蜡15min-100%乙醇吸取二甲苯10min-95%乙醇2min-90%乙醇2min-85%乙醇5min-70%乙醇7min-维多利亚蓝B 8min-95%乙醇1min-蒸馏水洗3min-丽春红滴染5min-100%乙醇5min-二甲苯Ⅰ 10min-二甲苯Ⅱ 5min-中性树脂封固。观察肝脏汇管区胶原纤维沉积量及程度，进行评分纤维化分期。

1.2.4 肝组织切片进行Masson(马松)三色染色[3]二甲苯Ⅰ脱蜡15min-二甲苯Ⅱ脱蜡15min-100%乙醇吸取二甲苯10min-95%乙醇2min-90%乙醇2min-85%乙醇2min-蒸馏水洗2min-Bouin液56℃ 1h-流水冲洗至无色-天青石蓝染液5min-苏木精染色5min-自来水冲洗1min-1%盐酸酒精分化(提插数下)-自来水冲洗2min-丽春红酸性品红染液10min-蒸馏水洗2min-1%磷钼酸5min-亮绿5min-1%冰醋酸5min-95%乙醇Ⅰ 1min-95%乙醇Ⅱ 1min-100%乙醇Ⅰ 1min-100%乙醇Ⅱ 1min-二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-中性树脂封固。观察肝脏汇管区胶原纤维沉积量及程度，进行评分纤维化分期。

1.2.5 肝组织切片进行网状纤维染色 二甲苯Ⅰ脱蜡15min-二甲苯Ⅱ脱蜡15min-100%乙醇吸取二甲苯10min-95%乙醇2min-90%乙醇2min-85%乙醇2min-蒸馏水洗2min-0.25%高锰酸钾2min-蒸馏水洗2min 2%草酸2min-蒸馏水洗2min-2%硫酸铁铵10min-蒸馏水洗2min-氨银液滴染5min-蒸馏水洗2min2%硫代硫酸钠2min-蒸馏水洗2min-100%乙醇5min-二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-中性树脂封固。观察肝脏汇管区网状纤维融合、塌陷程度，进行评分纤维化分期。

1.2.6 肝组织切片进行天狼星红染色[4]二甲苯Ⅰ脱蜡15min-二甲苯Ⅱ脱蜡15min-100%乙醇吸取二甲苯10min-95%乙醇2min-90%乙醇2min-85%乙醇2min-蒸馏水洗2min-天青石蓝5min-蒸馏水洗2min-苦味酸天狼星红30min-100%乙醇5min-二甲苯Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ 15min-中性树脂封固。Leica DM2500偏光镜下观察肝脏汇管区胶原纤维沉积量及程度，进行评分纤维化分期，同时对胶原纤维进行分型，区分Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。

2 结果

2.1 HE染色 细胞核呈蓝色，胞浆和其他组织成分呈现出深浅不一的红色，肌纤维呈现红色、红细胞呈朱红色、嗜酸性颗粒橙红色。正常组肝脏切片组织结构表现为，肝小叶为类圆形，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶结构完整，呈不规则形，汇管区周围肝细胞多边形，核圆形蓝色位于细胞中央，胞质红色，肝细胞成条索状排列形成肝板，肝板之间的空隙为肝血窦。为正常肝组织结构，见插页图A。模型组肝脏切片组织结构表现为，中央静脉缺如、肝小叶及汇管区结构不明显，有大量的胶原纤维生成，相互连接，包绕着肝细胞群，形成环形形态、形状不一的假小叶结构；假小叶结构中的肝细胞散在，索状排列不明显，间隙大，肝脏切片呈现大面积假小叶组织结构，属坏死后肝硬变，肝细胞内可见明显的圆形空泡，为脂肪变性所致，假小叶周边的肝细胞可见明显的嗜酸性变和气球样变，假小叶周边的纤维组织内可伴有明显的出血改变，见插页图B。

2.2 弹力胶原纤维染色 胶原呈红色，肌肉、神经胶质呈黄色，细胞核呈蓝绿色。正常组胶原纤维少见，只局限于血管壁周围，属正常范围，见插页图C。模型组肝组织内大量胶原纤维沉积，汇管区周围胶原纤维沉积，纤维条索较粗且染色着色较深，表明胶原纤维较多，包裹，已形成假小叶，见插页图D。

2.3 Masson(马松)三色染色 胶原呈蓝色，胞质、肌纤维、红细胞呈红色，胞核蓝褐色。正常组血管壁周围可见少量胶原纤维，属正常范围，见插页图E。模型组肝组织内大量胶原纤维沉积，呈蓝色，自汇管区周围向外延伸，纤维条索较粗且染色着色较深，表明胶原纤维较多，包裹，已形成假小叶，见插页图F。

2.4 网状纤维染色 网状纤维呈黑色、胶原纤维呈深黄色。正常组网状纤维呈絮网状均匀分布于肝组织中，未见网状纤维增粗、网状纤维融合、塌陷。见插页图G。模型组肝组织内网状纤维失去正常分布状态，自汇管区周围网状纤维塌陷、融合、增粗、包裹并已形成假小叶，见插页图H。

2.5 天狼星红染色 Ⅰ型胶原纤维紧密排列，显示很强的双折光性，为黄色或红色的纤维，Ⅱ型胶原显示弱的双折光性，呈多种颜色的疏松网状分布；Ⅲ型胶原纤维为疏网状，显示弱的双折光性，为绿色的细纤维；Ⅳ型胶原纤维显示弱的双折光性的基膜，呈淡黄色。正常组胶原纤维紧局限于汇管区血管壁，偏光镜下观察可见红色Ⅰ型胶原纤维、少量疏网状Ⅱ型胶原纤维、绿色Ⅲ型胶原和少量淡黄色Ⅳ型胶原纤维，属正常含量范围，见插页图1。模型组各型胶原纤维自汇管区向外扩展，偏光镜下观察可见胶原沉积、扩展已形成假小叶，其中大量红色Ⅰ型胶原纤维、绿色Ⅲ型胶原，少量疏网状Ⅱ型胶原纤维和淡黄色Ⅳ型胶原纤维，见插页图J。

3 讨论

HE染色着重评价细胞变性、坏死等形态改变。弹力胶原纤维染色针对纤维化肝组织，重点着色为胶原、肌肉、神经胶质，一般细胞核不易着色。Masson染色对胶原、胞质、肌纤维、红细胞进行染色。网状纤维染色对肝组织网状纤维、胶原纤维进行染色，但氨银颗粒对背景影响较大，根据查阅文献及反复比较实验，对此进行优化，氨银液处理后应用蒸馏水冲洗，以免自来水中的杂质、氢离子与氨银液反应。氨银液染色后染液不能倒掉，需直接用大流量自来水快速冲洗[5,6]，避免多余的银颗粒沉淀在组织和玻片上，同时此步骤容易出现脱片现象，为避免脱片尽量使用防脱片载玻片，或对普通载玻片进行3%明胶浸泡处理。天狼星红是一种很强的酸性染料，每个分子内含有6 个磺酸基，可以和胶原分子碱性氨基酸反应，有较强的双折光现象，较好的提高Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的分辨率，在实验需要时可以对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原进行定量分析。天狼星红又是一种长型展开的分子与胶原分子吸附反应极稳定，故染色后不易褪色，具有较强的特异性，因此它是目前对胶原显示的最好的染色方法[7]。