某公园狼伪狂犬病的诊断

王贺伟 ， 刘书梅 ， 陈瑞利 ， 李进萍 ， 王双山

(1.河南省安阳市动物卫生监督所 ， 河南 安阳 455002 ； 2.安阳工学院生物与食品工程学院 ， 河南 安阳 455000 ；3.河南省安阳市人民公园 ， 河南 安阳 455001)

2017年1月3日，安阳市某公园1只1岁母狼死亡，疑似伪狂犬病(PR)，前来就诊。经流行病学调查、病理解剖学及实验室综合诊断，确诊为狼伪狂犬病。随后采取了防控措施，没有出现新的病例。本文通过临床和实验室综合诊断确定该病由伪狂犬病病毒引起，提示动物(公)园在饲养狼及其他犬科动物时，应该重视该病的预防，采取综合的管理和防制措施，有效预防和减少因感染该病而导致发病和死亡。

1 病例介绍

该公园饲养狼6只，近两年来没有发生不明原因死亡。2017年1月3日上午，饲养员发现1只狼口吐白沫，呼吸困难，呈现腹式呼吸、呼吸音粗厉、不断后退且转圈运动。逐渐发展为呻吟不安，阵发性抽搐，四肢麻痹，发病后约6 h死亡。

饲养员介绍：未出现过类似病情。该狼发病前1天，精神状态、营养状况、体质、饮食情况等均与其他狼无异，死前没有发现有外界因素的干扰；饲料来源于安阳市某屠宰厂的猪肉胴体，饮用水为公园统一供应。

2 病理剖检

对送检狼进行剖检，尸体脱水，皮肤干瘪。肝有明显的出血点和坏死点(见中插彩版图1)，小肠(见中插彩版图2)、大肠弥漫性出血(见中插彩版图3)，肺脏水肿、充血。脑膜水肿、充血、出血，脊髓积液增多(见中插彩版图4)。其他器官仅见轻微眼观病变。

3 实验室诊断

3.1 细菌鉴定 无菌采取死亡狼的肝脏、脾脏、淋巴结和肺脏组织涂片镜检，未见细菌。同时接种血液琼脂平板和麦康凯琼脂平板进行细菌分离培养，37 ℃培养48 h观察，亦未见细菌菌落。

3.2 动物试验

3.2.1 病料处理 采集狼大脑、脾脏、肺脏以及扁桃体等不同部位的样品，混合后在研磨器中进行充分研磨，然后加入1∶10倍含有浓度分别为1 000 mg(μg)/mL青霉素和链霉素的无菌生理盐水，放进冰箱中，反复冻融3次，再在离心机上进行离心，取上清液放置冰箱后备用。

3.2.2 试验观察 将4只健康兔分为对照组2只和试验组2只，然后进行编号和标记。试验组分别在颈部皮下接种上述病料的上清液2 mL，对照组分别在颈部皮下接种无菌生理盐水2 mL。接种后进行观察和体温测定。

3.2.3 动物试验结果 试验组兔体温升高到41.8 ℃，精神沉郁、呼吸急促。随后接种部位奇痒，兔子兴奋不安、尖叫，舔咬颈部接种部位，用颈部摩擦兔笼，以致被毛脱落、皮肤损伤出血，直至完全麻痹，3 d死亡。 2只试验兔子病情相同。死后剖检，大脑充血、出血，并采取病料做PCR检测。对照组隔离观察7 d，均没有出现任何症状。

4.3 PCR检测

4.3.1 DNA提取 分别无菌采取狼、动物试验死亡兔的，脑、扁桃体和肺3个部位样品约1 g，放入灭菌试管中，再加10 mL无菌生理盐水，再用分散机进行充分研磨直至无块状物，制成混悬液，然后分别将混悬液转至1.5 mL灭菌离心管中，8 000r/min离心2 min，取0.2 mL上清于1.5 mL灭菌的离心管中。用深圳市康百得生物科技有限公司生产的猪伪狂犬病病毒PCR检测试剂盒，按操作说明书提取上清液中的DNA。

4.3.2 PCR反应 按上述PCR试剂盒说明书要求操作。总体积为20 μL，含16 μL PCR反应液(A液)、2 μL混合酶(B液)、2 μL模板DNA。PCR反应循环参数为： 94 ℃ 3 min ；循环94 ℃ 30 s、65 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，共 40次；再72 ℃延伸10 min。

4.3.3 PCR结果 分别取狼、兔2个PCR产物10 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结果显示，采取狼和兔的脏器样品，进行PCR均扩增出220 bp大小的特异性条带，与阳性对照相符，阴性对照则没有出现目的条带，表明所检测病料PRV阳性，结合临床症状、病理剖检、细菌分离和动物试验，可诊断狼为PR感染。如图5。

图5 狼、试验死亡兔病料组织PRV PCR电泳检测结果

5 讨论

本次对公园死亡狼采用综合临床诊断和实验室诊断，确诊死狼为狼伪狂犬病。狼并不是伪狂犬病病毒(PRV) 的原发宿主，目前普遍认为猪是PRV 主要的自然宿主和储存宿主，而且长期带毒和排毒的动物，在伪狂犬病的传播上起着重要的作用。近年 PR 在猪群中广泛流行，其他动物的伪狂犬病发病率在逐年上升，这与PR 在猪群中广泛流行有密切关联。而其他动物主要通过食入鼠类，或家畜、鼠类尸体和尿液污染的饲料感染。该狼可能是生食带PRV的猪肉躯体感染而死亡。

在试验动物中，兔、豚鼠、小鼠等对PR均有易感性。在基层实验条件差的情况下，可采用兔做实验动物诊断PR，此法简便易行，技术要求不高，但必须遵循实验规则。

目前，该病尚无理想的特效药及治疗方法，其猪主要依靠免疫接种灭活疫苗或基因缺失苗来防控猪伪狂犬病，起到了较好的预防效果。但狼相对于猪对 PRV 更加敏感，商品用猪伪狂犬病疫苗对狼的安全性仍待商榷。因此，建议动物园(公园)对该病应引起重视并采取综合防控措施：(1)必须加强对饲料的管理，尤其是猪的副产品应熟喂，严禁饲喂来源不明的饲料；(2)加大对环境的卫生消毒力度、做好灭鼠工作，切断该病传播途径；(3)必要时可以考虑借鉴羊预防PR的办法，进行接种商品用猪伪狂犬病灭活疫苗。