气相色谱内标法测定植物油中角鲨烯含量

朱 琳 薛雅琳 刘晓辉 张 东 张东生,3

(国家粮食局科学研究院1，北京 100037) (普洱健源油脂有限公司2，普洱 665000) (江南大学3，无锡 214122)

气相色谱内标法测定植物油中角鲨烯含量

朱 琳1薛雅琳1刘晓辉2张 东1张东生1,3

(国家粮食局科学研究院1，北京 100037) (普洱健源油脂有限公司2，普洱 665000) (江南大学3，无锡 214122)

通过内标类型和用量的选择，在已有方法基础上建立了一种内标法测定植物油中角鲨烯含量的气相色谱法方法。以角鲨烷为内标，样品经氢氧化钾-甲醇皂化，正己烷萃取，采用HP-5毛细管谱柱，程序升温气相色谱条件。结果表明，角鲨烯的平均回收率为95.5%～103.0%，精密度为1.42%～5.89%，检出限为0.05 mg/kg。该方法不仅回收率高，重现性好，而且灵敏度高，该方法可用于测定植物油中角鲨烯含量，为科学评价植物油中营养成分提供技术支撑。

角鲨烯 角鲨烷 内标法 植物油 气相色谱法

角鲨烯是一种高不饱和的天然萜类化合物，属于脂质不皂化物，它最初是从鲨鱼的肝油中发现的，1914年被命名为Squalene，其化学名为(6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。它属于开链三萜，又称鱼肝油萜，也称鲨烯，具有提高体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、增强机体免疫能力、防癌、防心血管疾病、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能。因此，被广泛应用于医药和化妆品等相关领域[1]。

目前，国际AOAC(Revised 1996)标准中有测定角鲨烯含量的方法[2]，此方法通过不皂化物提取，柱色谱分离，最后采用滴定方法对角鲨烯进行定量，检测过程较为繁琐，且最后采用滴定法测量，误差较大[3]。文献报道植物油中角鲨烯含量测定的方法较多，主要有高效液相色谱法、气相色谱法、气质联用法等[4-9]。从采用的定量方式来看，利用高效液相色谱和气相色谱法多采用外标法定量，很少用到内标法，而气质联用法在定量方式主要采用内标法定量。从采用的前理处理方法来看，主要有溶剂稀释法、SPE柱法和皂化法。溶剂稀释法直接进样，不仅会污染色谱柱，缩短色谱柱使用寿命，而且杂质峰较多，影响与目标峰的分离；SPE柱法虽说能去除大部分油脂杂质，但是仍有部分杂质会残留，残留下来的杂质出峰时间较长，且使用SPE进行前处理油脂样品上样量小，对于角鲨烯含量较低的样品不适用，从目前的文献报道中看，也仅有角鲨烯含量较高的橄榄油用SPE进行前处理，该法前处理检测成本较高不适合推广使用；由于角鲨烯属于脂质不皂化物，因此本研究在文献基础上选择不皂物提取经典的方法——液液萃取法作为前处理方法。但不皂化物提取操作比较繁琐，难免会有所损失，而内标定量方法会减少操作上的误差，提高方法的准确性。因此，本研究通过内标种类和用量的选择，选出一种适用于气相色谱法定量角鲨烯的内标物质角鲨烷，建立一种以角鲨烷为内标测定植物油中的角鲨烯含量的气相色谱法，该法不仅分离效果好、灵敏度高、回收率高且成本低，适合植物油中角鲨烯含量测定方法推广使用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花生油、油茶籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、特级初榨橄榄油、大豆油8种植物油：市售。

氢氧化钾、乙醇、无水硫酸钠均为分析纯；正己烷为色谱纯；角鲨烯标准品(≥98%)、5α-胆甾烷标准品：美国sigma公司；角鲨烷标准品(≥98%)：东京化成工业株式会社；二十四烷标准品、正三十二烷标准品：北京百灵威科技有限公司。

7890A气相色谱仪(FID检测器)：安捷伦(Agilent)公司；旋转蒸发仪：瑞士步琪(Buchi)公司；氮吹仪：美国Organomation公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准品的配制

准确称取25 mg角鲨烯、25 mg角鲨烷标准品分别用正己烷定容于25 mL容量瓶，即配制成1 mg/mL角鲨烯标准储备液和1 mg/mL内标角鲨烷标准溶液。

1.2.2 样品前处理

准确移取300 μL角鲨烷内标溶液于250 mL磨口烧瓶中，在氮吹仪上吹干后，准确称取0.2～2 g样品于此烧瓶中，其余步骤同文献[9]。

1.2.3 色谱条件

气相色谱柱：HP-5毛细管柱，长30 m，内径0.32 mm，薄膜厚度0.25 μm；载气：高纯氮气(纯度99.999% )，恒压：16 psi，分流比1∶10；进样口温度：250 ℃；柱温采用程序升温方式，以15 ℃/min的速率从160 ℃升温到220℃，保持2 min，然后以5 ℃/min的速率升温到280 ℃，保持20 min；最后以5 ℃/min的速率升温到300 ℃，保持2 min；FID检测器：温度300 ℃，氢气流速40 mL/min，空气流速450 mL/min，尾吹气流速30 mL/min；进样量：1.0 μL。

2 结果与分析

2.1 内标物质的选择

采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。内标物选择的原则为内标物应当是试样中不存在的纯物质，这样内标物能准确加到样品中去；内标物应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好与被分析物质为同系物；同时，在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。根据以上特点，本研究从二十四烷、角鲨烷、5α-胆甾烷、正三十二烷中筛选作为植物油中角鲨烯含量测定的内标，按1.2.3色谱条件进行分析，这几种内标出峰时间分别为二十四烷9.4 min，角鲨烷12.9 min，5α-胆甾烷 19.4 min，三十二烷 20.6 min。通过8种植物油(花生油、油茶籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、特级初榨橄榄油、大豆油)进行测定，只有角鲨烷能与样品中各组分完全分离，且各植物油本底不含内标角鲨烷，同时，角鲨烷与角鲨烯结构相似，出峰位置较为接近且可完全分离，满足方法学中对内标的要求，因此，选用角鲨烷作为角鲨烯气相色谱法测定的内标物质。

2.2 内标加入量的选择

经查阅文献，内标加入量建议在待测物质的浓度曲线的1/6～1/3处[10]。1～160 μg/mL角鲨烯与峰面积的标准曲线见图1，内标角鲨烷加入质量浓度范围应为27～53 μg/mL。因此，加入终质量浓度为30 μg/mL内标溶液可以满足定量要求。

图1 角鲨烷内标加入量范围

2.3 样品称样量的确认

根据本方法样品最终定容至10 mL正己烷中，则对于角鲨烯含量≤800 mg/kg的植物油，加入终质量浓度为30 μg/mL角鲨烷内标，待测角鲨烯质量浓度最高为160 μg/mL，则推荐称样量为2 g可满足定量要求范围。

经查阅文献可知，在植物油中橄榄油的角鲨烯含量较高，最高可达7 000～8 000 mg/kg，对于角鲨烯>800 mg/kg的植物油，加入终质量浓度为30 μg/mL角鲨烷内标，待测角鲨烯质量浓度最高为160 μg/mL，则推荐称样量为0.2 g可满足定量要求范围。因此，根据样品角鲨烯含量不同，称量样品进行测定。

2.4 方法学评价

2.4.1 校正因子

配制30 μg/mL角鲨烷内标的角鲨烯工作液：将1 mg/mL角鲨烯标准储备液用正己烷稀释至质量浓度分别为2.5、5、10、20、50、100、200、300、400 μg/mL的标准工作液，并保证每个工作液中加入终质量浓度为30 μg/mL的角鲨烷的内标。角鲨烯与角鲨烷峰面积比为横坐标(X)，以角鲨烯与角鲨烷质量比为纵坐标(Y)，得到内标校正曲线为Y=1.010 7X，R2=0.999 8(n=4)，角鲨烯在质量浓度范围2.5～400 μg/mL与内标角鲨烷质量浓度30 μg/mL呈良好线性关系且定量范围较宽，该校正曲线的斜率1.010 7即为角鲨烯和角鲨烷的校正因子，因此，在给定的条件下，用氢火焰离子化(FID)检测器检测等量的角鲨烯和角鲨烷时可获得相同的响应值，即角鲨烯和角鲨烷的校正因子为1.0。所以在进行检测时可不用配制角鲨烯与角鲨烷的内标校准曲线，直接用加入样品中的内标量进行定量。

2.4.2 方法回收率和精密度

在已知角鲨烯含量的大豆油中分别加入不同浓度的角鲨烯标准品，低温避光振荡72 h，使角鲨烯标准品在大豆油中充分平衡，按建立的检测方法进行皂化、提取和检测，计算角鲨烯在201.18～8 002.13 mg/kg添加水平的回收率(同一水平样品组n=6)和精密度(RSD)。4个添加水平结果见表1所示，不同水平角鲨烯的回收率为95.5%～103.0%，相对标准偏差为1.42%～5.89%。角鲨烯和角鲨烷混合标准溶液色谱图见图2，加标前后样品色谱图见图3和图4。

图2 角鲨烯和角鲨烷混合标准溶液气相色谱图

图3 加标前样品气相色谱图

图4 加标后样品气相色谱图

表1 角鲨烯回收率和精密度试验结果(n=6)

2.4.3 方法检出限

以S/N≥3确定方法的检出限，该方法角鲨烯的检出限为0.05 mg/kg。

2.5 实际样品测定

分别取花生油、油茶籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、特级初榨橄榄油对其内角鲨烯含量按方法1.2.3进行测定，结果见表2。由表2可知，橄榄油中角鲨烯最高为5 770.40 mg/kg，其他油中的角鲨烯含量较低，含量最低的为芝麻油，仅含14.74 mg/kg。

表2 7种食用植物油中角鲨烯的含量

3 结论

目前，利用液液萃取法提取植物油中角鲨烯的方法主要利用外标法定量，但是由于液液萃取前处理方法操作较为繁琐，难免会有所损失。本研究通过8种植物油(花生油、油茶籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、特级初榨橄榄油、大豆油)，4种内标物质(二十四烷、角鲨烷、5α-胆甾烷、正三十二烷)进行筛选，选出一种适合气相色谱法定量植物油中角鲨烯的内标物质角鲨烷，只有角鲨烷能与样品中各组分完全分离，且各植物油本底不含内标角鲨烷，同时，对角鲨烷内标加入量进行选择，建立一种以角鲨烷为内标定量角鲨烯的气相色谱法，该方法加标回收率为95.5%～103.0%，精密度为1.42%～5.89%，检出限为0.05 mg/kg，由此可以看出，该方法不仅回收率高，重现性好，而且灵敏度高，该方法的建立不仅为植物油中角鲨烯的测定提供检测参考，同时为下一步科学评价植物油营养成分提供技术支撑。

[1]梁新华,郑彩霞,张风侠.甘草中角鲨烯高效液相色谱法测定[J]. 时珍国医国药, 2010, 21(8):1856-1857

Liang X H, Zheng C X, Zhang F X. Extraction and HPLC analysis of the squalene in glycyrrhiza uralensis fisch[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2010,21(8):1856-1857

[2]AOAC Official Method 943.04. Squalene in oils and fats titrmetric method[S]. AOAC,1996

[3]陈凤香,朱天仪,袁超. SPE-HPLC法测定橄榄油中角鲨烯的含量[J]. 粮食与油脂,2015,28(2):63-65

Chen F X, Zhu T Y, Yang C. Determination of squalene in olive oil by SPE-HPLC [J]. Cereals & Oils,2015,28(2):63-65

[4]张欣,于瑞祥,杨瑞钰,等.植物油中角鲨烯的提取与高效液相法分析[J]. 中国粮油学报, 2013,28(5):96-98

Zhang X, Yu R X, Yang R Y, et al. Extraction and HPLC analysis of the squalene in vegetable oils[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2013,28(5):96-98

[5]张青龄.橄榄油中角鲨烯含量的气相色谱/质谱法分析[J]. 福建分析测试,2011,20(3):1-4

Zhang Q L.Determination of squalene in olive oil by GC/MS [J].Fujian Analysis & Testing,2011,20(3):1-4

[6]车欣颖,卢雯.气相色谱法测定角鲨烯软胶囊中角鲨烯含量[J].齐齐哈尔医学院学报,2008,29(12):1475-1476

Che X Y, Lu W. Determination of squalene in squalene soft capsules by gas chromatography[J].Journal of Qiqihar Medical College,2008,29(12):1475-1476

[7]汪运明,陈华勇,杨继国,等.气相色谱质谱联用测定茶油中角鲨烯含量[J]. 食品工业科技,2011,32(6):404-406

Wang Y M, Chen H Y, Yang J G, et al. Determination of squalene in camellia oil by GC-MS [J]. Science and Technology of Food Industry,2011, 32(6):404-406

[8]唐小红,陈华勇,王永华,等.气相色谱质谱联用测定深海鱼油中角鲨烯含量[J]. 农业机械,2012(1):50-53

Tang X H, Chen H Y, Wang Y H, et al. Determination of squalene in deep sea fish oil by GC-MS [J]. Farm Machinery,2012(1):50-53

[9]张东生,薛雅琳,金青哲,等.油茶籽油中角鲨烯含量的测定[J]. 中国油脂,2013,38(11):85-88

Zhang D S, Xue Y L, Jin Q Z, et al. Determination of squalene in oil-tea camellia seed oil[J]. China Oils and Fats,2013,38(11):85-88

[10]IonSource, LLC. Principles of MS Quantitation[EB/OL].[2016-01-19]. http://www.ionsource.com /tutorial/msquan/is. htm.

Determination of Squalene in Vegetable Oils by Gas Chromatography with an Internal Standard

Zhu Lin1Xue Yalin1Liu Xiaohui2Zhang Dong1Zhang Dongsheng1,3
(Science Academy of State Grain Administration1，Beijing 100037) (Pu’er Jianyuan Oil Co.，Ltd.2，Pu’er 66500) (Jiangnan University3，Wuxi 214122)

An analytical method based on the previous studies was developed for the determination of squalene in vegetable oils using internal standard by gas chromatography. Squalane was chosen as internal standard. The samples were saponified with potassium hydroxide-ethanol solution, then extracted byn-hexane, and analyzed by gas chromatography. Column HP-5 was used in the study. The results indicated that the average recovery rate of squalene was 95.5%～103.0% with relative standard deviations of 1.42%～5.89%. The limit of detection for squalene was 0.05 mg/kg. The method could be used for determination of squalene in vegetable oil with high recovery, good reproducibility and high sensitivity. It was suitable for the determination of squalene in vegetable oils, and also provided technical support for the scientific evaluation of nutritional components in vegetable oils.

squalene, squalene, internal standard method, vegetable oil, gas chromatography

TS 225.1

A

1003-0174(2017)12-0117-04

“十三五”国家重点研发计划(2016YFD040 1403-3)

2016-12-26

朱琳，女，1984年出生，助理研究员，生物工程

薛雅琳，女，1960年出生，教授级高级工程师，粮油品质及标准研究