降压片微生物限度检查方法研究

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1.贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004;2.贵州圣济堂制药有限公司，贵州 贵阳 551400

降压片微生物限度检查方法研究

滕钰1薛咏兰1罗曼1李琴2徐洪1邹莉1王俊1*

1.贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004;2.贵州圣济堂制药有限公司，贵州 贵阳 551400

目的对降压片的微生物限度检查方法进行研究。方法通过研究降压片成分的抑菌特性，按《中国药典》2015年版四部通则1105、1106、1107进行微生物限度检查方法适用性试验。结果利用聚山梨酯80的中和作用，采用增大稀释液和培养基体积方法进行试验，计数方法适用性试验中，稀释液对照组与菌液对照组菌落数比值、试验组减去供试品对照组菌落数与菌液对照组菌落数比值均在0.5～2之间；控制菌检查方法适用性试验均能检出阳性对照菌。结论能够消除抑菌成分干扰且所添加中和剂对微生物生长无影响，重现性好，确保检测结果的有效性和准确性。

降压片；微生物限度检查；抑菌成分；方法适用性试验

降压片为非药典品种，主要由黄芩、檞寄生、决明子、山楂、臭梧桐叶、桑白皮和地龙等7味药物组成，具有降压功能[1]。《中国药典》2015年版[2]规定供试品微生物限度检查方法的适用性须经确认，以确保采用方法能适合于该产品的微生物检查。笔者针对降压片的成分抑菌特性和微生物限度标准等因素，对其微生物限度检查方法进行研究，并对其进行方法适用性试验，确定此方法的有效性。

1 仪器与材料

1.1 样品 降压片(贵州圣济堂制药有限公司：批号20170101、20170102、20170103,规格：0.5g)。

1.2 试验环境 在D级背景下的局部B级单向流空气的药品洁净实验室中进行，其中阳性菌操作在Ⅱ级生物安全柜中进行。

1.3 菌种 黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)[CMCC(B)26003]；铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]；大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]；枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]；乙型副伤寒沙门氏菌(SalmonellaparatyphiB)[CMCC(B)50094]；色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]；黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]，上述菌种均来源于中国药品生物制品检定所，试验用菌株均为第4代。

1.4 试剂 聚山梨酯80(成都市科龙化工试剂厂，批号：2014112601)。

1.5 培养基 胰酪大豆胨液体培养基(TSB)(批号：17032950)、胰酪大豆胨固体培养基(TSA)(批号：1703254)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)(批号：17031651)、沙氏葡萄糖液体培养基(SDB)(批号：150916)麦康凯液体培养基(批号：1703139)、麦康凯琼脂培养基(批号：1604055)、肠道增菌液体培养基(批号：1609072)、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基(批号：17061281)，均由北京陆桥技术股份有限公司提供；RV沙门菌增菌液体培养基(批号：3303081)、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基(批号：3105468)，均由广东环凯微生物科技有限公司提供。本实验室培养基适用性检查结果表明，上述批次培养基均符合2015年版《中国药典》要求。

1.6 仪器 PL602-L电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、DK- 98-II电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)、康氏振荡器(常州荣华仪器制造有限公司)、BF240恒温培养箱(Binder)、BSC-1300ⅡA/B3生物安全柜(ESCO)、MJ-250-1霉菌培养箱(上海一恒科技有限公司)。

2 方法

2.1 菌液制备 按《中国药典》2015年版四部通则1105、1106[2]要求进行制备。

2.2 供试液制备 取供试品10 g，加TSB(含10 %聚山梨酯80)至100 mL，振摇混匀，作为1∶10供试液。取20 mL 1∶10供试液，加TSB(含10 %聚山梨酯80)至100 mL，即得1∶50供试液。

2.3 微生物计数方法适用性试验

2.3.1 需氧菌总数计数 采用平皿倾注法。①试验组。取1∶50供试液5份，每份10 mL，分别加入0.1 mL不大于100 cfu/mL金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌液，混匀，取1 mL注入直径90 mm的无菌培养皿中，每株菌平行制备2个平皿，倾注20 mL温度为45 ℃左右的融化的TSA，迅速混匀，冷却凝固后倒置，于34 ℃条件下培养3 d，计数。②菌液对照组。取TSB代替供试液，其它操作同“试验组”。③供试品对照组。取1 mL 1∶50供试液注入直径90 mm的无菌培养皿中，平行制备2个平皿，其它操作同“试验组”。④中和剂对照组。取含10 %聚山梨酯80的TSB代替供试液，同“试验组”操作。⑤阴性对照组。取TSB代替供试液，不加试验菌，其它操作同“试验组”。

2.3.2 霉菌和酵母菌总数计数 采用平皿倾注法。①试验组。取1∶10供试液2份，每份10 mL，分别加入0.1 mL不大于l00 cfu/mL白色念珠菌和黑曲霉菌液，混匀，取1 mL注入直径90 mm的无菌培养皿中，每株菌平行制备2个平皿，倾注45 ℃左右的融化的SDA 20 mL，迅速混匀，冷却凝固后倒置，于34 ℃条件下培养3 d，计数。②菌液对照组。取TSB代替供试液，其它操作同“试验组”。③供试品对照组。取1 mL 1∶10供试液注入直径90 mm的无菌培养皿中，平行制备2个平皿，其它操作同“试验组”。④中和剂对照组。取含10 %聚山梨酯80的TSB代替供试液，同“试验组”操作。⑤阴性对照组。取TSB代替供试液，不加试验菌，其它操作同“试验组”。

2.3.3 回收率计算 本试验为了消除干扰物的抑菌活性，稀释剂中加入了中和剂(聚山梨酯80)，为确认其对微生物无毒性，中和剂对照组与菌液对照组的菌落数比值应在0.5～2范围内，方能确认试验的有效性。计数方法适用性试验回收率=(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液组菌落数，所得结果应在0.5～2范围内。

2.4 控制菌检查方法适用性试验

2.4.1 试验组 ①大肠埃希菌。取1∶10供试液10 mL,接种至100 mL TSB，加入不大于l00 cfu·mL-1大肠埃希菌，混匀，34 ℃条件下培养18 h，取其培养物1 mL接种至麦康凯液体培养基，43 ℃培养24 h，取麦康凯液体培养物划线于麦康凯固体平板，34 ℃条件下培养18 h，观察结果。②耐胆盐革兰阴性菌。取1∶10供试液，23 ℃预培养2 h，分别取1 mL预培养物接种至两管20 mL肠道菌增菌液中，分别加入不大于100 cfu·mL-1大肠埃希菌、铜绿假单胞菌，混匀，34 ℃培养24 h，分别取上述培养物划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板，34 ℃培养18 h，观察结果。③沙门菌。取10 g供试品至200 mL TSB，加入不大于100 cfu·mL-1沙门菌，混匀，34 ℃培养18 h，取0.1 mL上述培养物接种至10 mL RV 沙门菌增菌液体，34 ℃培养18 h，取上述培养物划线于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板，34 ℃培养18 h，观察结果。

2.4.2 供试品对照组 不加试验菌，其它操作同“试验组”相应控制菌检查法。

2.4.3 中和剂对照组 取含10 %聚山梨酯80胰酪大豆胨液体培养基代替供试液，同“试验组”操作。

2.4.4 阴性对照组 取胰酪大豆胨液体培养基代替供试品，同“供试品对照组”操作。

3 结果

3.1 微生物计数方法适用性试验 对3个批号降压片的需氧菌、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验，可观察出供试品对照组均无菌生长；中和剂对照组与菌液对照组菌落数比值均在0.90以上，说明加入聚山梨酯80并未对菌株的生长造成影响。试验组减去供试品对照组菌落数与菌液组菌落数比值也均在0.80以上。表明可采用该供试液制备方法和计数法测定该品种的需氧菌、霉菌和酵母菌总数。见表1。

3.2 控制菌检查方法适用性试验 对3个批号降压片的大肠埃希菌、耐胆盐格兰阴性菌、沙门菌控制菌检查方法适用性试验，可看出供试品对照组均无菌生长，中和剂对照组、试验组均能检出相应阳性菌。说明可采用该供试液制备方法和控制菌检查法。见表2。

表1 计数方法适用性试验结果 (n=3)

表2 控制菌检查方法适用性试验结果

注：“+”表示检出相应阳性菌，“-”表示无菌生长。

4 讨论

降压片的药物成分黄芩、地龙对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌及白色念珠菌等均有较强抑制作用[3-5]，故在试验初期考虑采用加聚山梨酯80进行中和。试验中发现，加入中和剂1∶10供试液进行方法适用性试验时，金黄色葡萄球菌不生长。另有研究表明，降压片成分中决明子、山楂对细菌的抑制能力较强[6-8]，而对霉菌抑制不明显。因此针对需氧菌计数，本研究以增加稀释液体积来进行方法适用性试验，最终采用1∶50供试液时，五株菌回收率均能达到要求。在控制菌检查中，由于样品中多种成分对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌有抑菌作用，故将耐胆盐革兰阴性菌中培养基的体积增大为20 mL，方能检出相应的阳性对照菌；在沙门菌检查中，将TSB体积从100 mL增大为200 mL时，可检出阳性对照菌，这可能与黄芩对伤寒沙门菌敏感[3]有关。

由于组方成份复杂、剂型和给药途径的多样性，中成药品中微生物难分离培养的情况相对较多。某些检验方法可能会因为不能有效检识药品中存在的有害微生物，从而出现达不到方法重现性要求的问题；可通过研究品种抑菌特性，采取合规技术手段并结合方法适用性试验来解决上述问题。针对单位辖区内企业所生产药品品种进行微生物限度检查方法适用性研究，有助于提高制药企业微生物安全的风险防控能力，有力保障辖区内民族药业的发展优势。

[1]中华人民共和国药典委员会.卫生部药品标准中药成方制剂(第四册)[M].北京：人民卫生出版社，1991：96.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部) [S]. 北京：中国医药科技出版社，2015：136-140.

[3]夏美玲，吕丽艳，刘野，等.5种中草药体外抑菌实验的研究[J].齐齐哈尔医学院学报，2009，30(24)：3024-3025.

[4]马廉兰，李娟，刘志春，等.五味子等中草药对肠道致病菌和条件致病菌的抗菌作用[J].赣南医学院学报，2003，23(3)：241-244.

[5]陈随清，崔瑛，靖慧军，等.地龙抑菌作用初步观察[J].中药材，2003，26(5)：354-355.

[6]俞利平，蔡玲斐.金银花、苦丁茶、野菊花、决明子的抗菌性能测定[J].杭州医学高等专科学校学报，2003，24(2)：77-78.

[7]刘斌，巩鸿霞，肖学凤，等.决明子化学成分及药理作用研究进展[J].药物评价研究，2010，33(4)：312-315.

[8]袁永成.山楂粗黄酮抗氧化能力及抑菌活性研究[J]. 农产品加工学刊，2012(2)：53-56.

StudyonMicrobialLimitTestMethodofJiangyaTablet

ObjectiveTo develop microbiological examination method of the Chinese Pharmacopoeia(Ch.p)2015 Edition for Jiangya tablet.MethodsAccording to the 4th general rules1105,1106 and 1107 of 2015 Edition,the method suitability test both of microbial counting and control bacterial examination in three batches of smples after studying the antibacterial properties of the Jiangya tablet.ResultsWith expanding liquid volume and polysorbate 80 being taken, the colony ratio between the control group and the microbial group was in the range of 0.5～2.And the colony ratio between the test group minus sample group and microbial group was between 0.5 and 2 in the counting suitability test of aerobic bacteria，which was also taken of mould and yeast. Meanwhile the control bacteria were detected in the test group.ConclusionThe bacteriostasis interference of Jiangya tablet was eliminated by the methods which had been described above and the methods were feasible and reproducible.

Jiangya Tablet; Microbial Limit Check; Bacteriostasis; Method Suitability Test

贵州省民族药微生物检测及安全防控技术应用研究,贵阳市科技计划项目(筑科合同编号:20171001号)。

滕钰(1987-)，女，汉族，硕士研究生，主管技师，研究方向为微生物检验。E-mail：434640096@qq.com

王俊(1974-)，男，本科，副主任技师，研究方向为药品微生物检验。E-mail：362983170@qq.com

R285

A

1007-8517(2017)23-0047-03

TENG Yu1XUE Yonglan1LUO Man1LI Qin2XU Hong1ZOU Li1WANG Jun1*

1.Guizhou Institute for Food and Drug Control，Guiyang 550004,China;2.Guizhou shengjitang Pharmaceutical Co.,Guiyang 551400,China

2017-10-26 编辑：穆丽华)