蒙药那如三味丸入血成分初步研究

1.广东药科大学药科学院，广东 广州 510006；2.广州医科大学附属第二医院番禺院区骨科，广东 广州 511447；3.广东省人民医院，广东 广州 510080

蒙药那如三味丸入血成分初步研究

胡弟1布林白乙拉2何桂松2高秋红1王经韵3何冰*

1.广东药科大学药科学院，广东 广州 510006；2.广州医科大学附属第二医院番禺院区骨科，广东 广州 511447；3.广东省人民医院，广东 广州 510080

目的通过研究蒙药那如三味丸的入血成分，进一步了解其药效物质基础。方法采用高效液相色谱法(HPLC)，建立蒙药那如三味丸大鼠灌胃后血清指纹图谱，分析其入血成分。结果在蒙药那如三味丸的含药血清中发现3种入血成分：乌头碱、胡椒碱和没食子酸。结论乌头碱、胡椒碱和没食子酸为蒙药那如三味丸的主要入血成分，是蒙药那如三味丸的有效成分。

蒙药那如三味丸；高效液相色谱；血清指纹图谱

蒙药那如三味丸由制草乌、荜茇、诃子配伍组成，出自蒙医经典著作《至高要方》。具有祛黄水、杀“粘”、消肿、止痛功效，主治风湿病，是蒙药制剂中治疗风湿的常用制剂之一[1]。近年来也应用于颈椎病、三叉神经痛、腰椎间盘突出症等疾病的治疗。前期的研究[2-4]发现蒙药那如三味丸所为天然药物对脊髓损伤(SCI)具有抗炎及保护神经细胞功能的作用。笔者拟采用高效液相色谱法，分析大鼠口服蒙药那如三味丸后血清中的移行成分，建立其体内分析方法，分离并鉴定其入血成分，为进一步研究蒙药那如三味丸药效物质基础提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 药品与试剂 那如三味丸(批号：1701050，内蒙古蒙药股份有限公司)，对照品(乌头碱，批号0161107991，纯度98.914%；胡椒碱，批号0166150309，纯度99.783%；没食子酸，批号0168141223，纯度98.837%)购予华夏标准物质中心，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器 Aglient-1200高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)、冷冻微型离心机(贝克曼库尔特有限公司)、飞鸽牌TDL离心机(上海右一仪器有限公司)。

1.3 动物 SPF级SD大鼠(南方医科大学实验动物中心)，(250±25)g，雌雄各半。许可证号:SCXK(粤)2016-0041。

2 方法

2.1 色谱条件 Dikma C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；A(甲醇)B(1%磷酸)，梯度洗脱(0～20 min，15% A: 85% B→80% A ：20% B；20～30 min，80% A:20%B→15%A:85%B)；检测波长 285 nm；流速 1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样体积：20 μL。

2.2 对照品溶液配制 精密称取乌头碱、胡椒碱、没食子酸标准品适量，分别置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分别制成每1 mL含0.1 mg乌头碱、0.106 mg胡椒碱及0.970 mg没食子酸的溶液。保存在4℃的避光冰箱中备用。

2.3 含药血清及空白血清的制备 取SD大鼠10只随机分为给药组和空白组。给药组每日1.0 mL/100 g 灌胃那如三味丸-0.5%羧甲基纤维素钠混悬液(浓度C=0.3 g/mL)，连续给药7 d，采血前24 h禁食，采血前2 h再灌胃1次，末次给药1 h后，3%戊巴比妥钠0.15 mL/100g腹腔注射麻醉，颈动脉采血5 mL。4 ℃，于无菌离心管中静置30 min，离心5 min(4 000 r/imn)，取上层血清于5 mL具塞离心管中，置于-20 ℃下冷冻保存。空白组每日0.5%羧甲基纤维素钠1.0 mL/100 g灌胃，连续给药7 d，同法制备空白血清。

2.4 血浆样品前处理方法 在血浆样本1.0 mL中加入两倍量乙酸乙酯，涡旋混合1 min，离心10 min(10000 r/min)，取上清，氮气常温吹干，残渣加入200 μL的甲醇溶液涡旋混合溶解，低温离心15 min(10000 r/min，4 ℃)，取上清，置于-20 ℃下冷冻保存，待测。

3 结果

3.1 系统专属性实验 将供试动物的空白血清色谱图与空白血清中分别各加入对照品没食子酸、乌头碱和胡椒碱后得到的色谱图及给药后大鼠血浆处理后的含药血清色谱图进行比较，结果表明血清中无内源性物质干扰测定,且两者峰形良好。如图1～图5所示。

3.2 标准曲线绘制 取空白全血1.00 mL，分别加入内标溶液和一系列浓度的乌头碱、胡椒碱和没食子酸标准液。浓度为0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 μg/mL，按照“2.4血浆样品前处理方法”项下方法操作，按照“2.1仪器条件”测定，峰面积为纵坐标y，浓度为横坐标x，求得直线回归方程为：测得乌头碱、胡椒碱和没食子酸在0.5～100 μg/mL内线性关系良好。乌头碱标准曲线：y=102.83x+12.59，r=0.99921;胡椒碱标准曲线：y=72.94x+8.363，r=0.99981，没食子酸标准曲线：y=36.33x+108.36，r=0.99956。

3.3 精密度与准确度实验 取空白全血1.00 mL，配置成血药浓度分别为0.5、5.0、50.0 μg/mL的样品，加入按照“2.4血浆样品前处理方法”项下方法操作，每一方法进行3次样本分析，并与标准工作曲线同时进行,以当日的标准工作曲线计算质量控制样品浓度，考察方法的精密度和准确度。结果表明，共有的相对峰面积RSD为1.65%～9.07%，精密度与准确度良好。

3.4 稳定性实验 取空白全血1.00 mL，配置成血药浓度分别为1.5、15.0、90.0 ug/mL的样品，加入按照“2.4血浆样品前处理方法”项下方法操作，常温放置24 h进样分析，以当日的标准工作曲线计算质量控制样品浓度,考察方法的稳定性。结果表明，共有的相对峰浓度RSD为0.6%～1.41%，稳定性良好。

3.5 血清指纹图谱分析 图1为空白血清HPLC图谱，在图2、图3、图4中均可见与图1相对应的血清内源性干扰色谱峰1、2号峰，图2中a峰为没食子酸对照品的血清HPLC色谱峰，图3中b峰为乌头碱对照品的血清HPLC色谱峰，图4中c峰为胡椒碱对照品的血清HPLC色谱峰。图5含药血清色谱图中均可见a、b、c色谱峰与图2、图3、图4中a、b、c色谱峰相对应的共有峰，出峰时间分别为分别均为5.061、16.664和22.867 min，以上结果提示大鼠口服蒙药那如三味丸后的入血成分含有没食子酸、乌头碱和胡椒碱。

4 讨论

研究在分析对照品和血清样品时，均采用了完全相同的色谱条件，因此，建立的没食子酸、乌头碱和胡椒碱对照品血清HPLC图谱与含药血清的HPLC图谱中的色谱峰能够满足一一对应的关系，同时进行了方法学考察，均满足分析检测的要求。在处理血清样品时，考察了有机试剂沉淀法、热水浴法，考虑处理方法对色谱峰的干扰影响，最终确定采用乙酸乙酯沉淀法处理血清样本，采用氮气低温浓缩法富集血中的成分，以获取更多的信息。

研究通过血清指纹图谱研究方法初步研究蒙药那如三味丸入血成分，蒙药那如三味丸血清HPLC指纹图中可检出多个色谱峰，其中血清本身的成分2个色谱峰1、2号，见图1和图5，蒙药那如三味丸中已知的主要成分有没食子酸，乌头碱和胡椒碱[1，5-6]，这3种主要成分均可从含药血清中检出，见图2中的a峰、图3中的b峰及图4中的c峰。这3个入血成分可能为蒙药那如三味丸的体内直接作用物质，对其进行深入的研究，将有助于阐明蒙药那如三味丸药效物质基础及药效机制，而蒙药那如三味丸含药血清中的其他移行成分还需进一步研究。

[1]孙国园，武娜，董玉. 蒙药那如三味丸的研究进展[J]．内蒙古医科大学学报，2013,35(2)：146-150.

[2]布林白乙拉，袁华兵，屠原原. 蒙药那如三味丸方对脊髓髓损伤后神经细胞FOS表达的影响[J]．中国中医药资讯，2009，12，1(6)：30-31.

[3]布林白乙拉，罗利民，陈继铭，等.交通性脊髓损伤致截瘫病人用蒙药那如三味丸治疗66例观察[J].中国医药导报杂志，2009，1(3)：45-46.

[4]吴绍春，布林白乙拉. 蒙药那如三味丸抑制辐射诱导小鼠细胞凋亡的影响的研究[J]．中国基层医药，2008，15(4)：25-26.

[5]陶淑娟，王桂艳，毕开顺．HPLC法测定蒙药那如三味丸丸中胡椒碱的含量[J]．沈阳药科大学学报，2004，21(1)：35- 37.

[6]陶淑娟，邵太丽，毕开顺．高效液相色谱法测定蒙药那如三味丸丸中没食子酸的含量[J]．时珍国医国药，2005，16 (1)：2-3.

[7]徐维明，杨松.药用植物草乌的化学成分研究进展[J]. 贵州农业科学，2012,40(3):54-58.

TheStudyonComponentsAbsorbedintoBloodofTraditionalMongolianMedicineNaruSanweiPill

HU Di1Bulinbaiyila2HE Guisong2GAO Qiuhong1WANG Jingyun3HE Bing1*

1. College of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China；2.Panyu Hospltal District Department of orthopedics,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 511447, China；3. Guangdong General Hospital,Guangzhou 510080,China

ObjectiveThrough the study of the blood components of the Mongolian medicine-Naru-3,to further understand the basis of the drug effect.MethodsHPLC was used to establish the serum fingerprint of the Mongolian medicine-Naru-3, and the blood components were analyzed.Results3 kinds of blood components were found in the serum containing three flavored pills of Mongolian medicine-Naru-3: aconitine, piperine and gallic acid.ConclusionAconitine, piperine and gallic acid are the main components of the Mongolian medicine, such as the three flavored pills, which are the effective components of the Mongolian medicine-Naru-3.

Mongolian Medicine Naru Sanwei Pill; HPLC; Serum Fingerprint

广东省科学技术厅省中医药科学院联合科研专项项目(粤科社字[2013]102号) 2016 年广东省大学生创新训练项目(201610573039)。

胡弟(1995-),男，汉族，本科，研究方向为药物分析。E-mail: 845940943@qq.com

何冰(1959-),女，汉族，本科，教授，研究方向为心血管药理、药物筛选及新药研究。E-mail:wahah5566@163.com

R284.1

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1007-8517(2017)23-0026-03

2017-10-27 编辑：邓佳丽)