虎杖不同组织器官中二苯乙烯类及蒽醌类资源性化学成分的分析与评价△

黄星昱，郭盛，朱邵晴，严辉，钱大玮，段金廒

(南京中医药大学江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023)

·专题·

虎杖不同组织器官中二苯乙烯类及蒽醌类资源性化学成分的分析与评价△

黄星昱，郭盛*，朱邵晴，严辉，钱大玮，段金廒*

(南京中医药大学江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023)

目的对蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc不同组织器官(叶、茎、枝、根茎和根)中二苯乙烯类和蒽醌类资源性化学成分进行分析评价，为其资源综合利用提供数据支撑。方法采用高效液相色谱法对虎杖不同组织器官中的二苯乙烯类(虎杖苷、白藜芦醇)及游离型蒽醌类(大黄素、大黄素甲醚)和结合型蒽醌类成分的含量进行测定。结果虎杖植物中二苯乙烯类及蒽醌类资源性物质主要分布于地下根及根茎，并整体呈现出根、根茎、茎、枝、叶渐次减少的分布规律。两类成分在地下部位尤以根皮部位分布丰富，其二苯乙烯类成分虎杖苷、白藜芦醇含量分别达50.06、5.17 mg·g-1，游离大黄素和大黄素甲醚含量分别达5.75、0.38 mg·g-1，结合型大黄素和大黄素甲醚含量分别达5.26、0.43 mg·g-1。结论虎杖植物中二苯乙烯类和蒽醌类资源性化学成分分布部位具有一定的局限性，研究结果为虎杖植物资源的综合利用提供了数据支撑。

虎杖；非药用部位；分析评价；二苯乙烯类；蒽醌类

虎杖为蓼科蓼属多年生草本植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根茎和根，具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功能，常用于湿热黄疸、淋浊、带下、风湿痹痛、痈肿疮毒、水火烫伤、经闭、癥瘕、跌打损伤、肺热咳嗽[1]。虎杖植物在我国大部分地区均有分布，主产于江苏、四川、陕西、江西、山东等地。现代研究显示，虎杖及其提取物具有抑菌、抗病毒、抗炎镇痛、心脑血管系统保护、抗肿瘤、调节免疫等药理作用[2]，其生物活性组分主要为以虎杖苷、白藜芦醇为代表的二苯乙烯类化合物和以大黄素、大黄素甲醚为代表的蒽醌类化合物[3-6]。近年来，随着人们对虎杖中主要活性成分白黎芦醇研究的不断深入，其开发利用的领域在不断扩展，资源消耗量日渐增大，人工栽培生产已逐渐成为目前商品药材供应的主要来源。而在其采收过程中，大量地上茎叶无有效利用途径而废弃。为此，本研究围绕虎杖植物药用部位根、根茎及其地上传统非药用部位中含有的二苯乙烯类及蒽醌类活性成分的分布进行分析评价，旨在为虎杖资源的综合利用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters 2695 Alliance高效液相色谱系统(含四元泵、在线脱气及自动进样系统，Waters公司)，2996型二极管阵列检测器(Waters公司)；分析天平(1/10 000，瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q Integral 5超纯水系统(美国Merck Millipore公司)；超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；Microfuge©22R Centrifuge离心机(美国Beckman Coulter公司)。

1.2 试剂

对照品虎杖苷(批号：lw16062005)、白藜芦醇(批号：lw16040901)、大黄素(批号：lw16071004)及大黄素甲醚(批号：DHJM20140926)均购自南京良纬生物科技有限公司，质量分数均大于98%。色谱甲醇(江苏汉邦科技有限公司)，色谱乙腈(德国默克公司)，其他试剂均为分析纯；超纯水为自制。

1.3 材料

虎杖新鲜植株于2017年7月采自南京中医药大学药用植物园，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.。样品采集后分离为根木质部、根皮、根茎、叶、茎及枝6个不同部位及器官，40 ℃烘干后粉碎成粗粉，置干燥器中备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

PhenomenexGemini C6-Phenyl(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；柱温：30℃；流动相：0.5%甲酸(A)和乙腈(B)，线性梯度洗脱(0 min，85% A；30 min，65% A；50 min，35% A)；流速：1 mL·min-1；检测波长：306、280 nm。对照品与样品色谱图见图1。

注：A.混合对照品，B.虎杖根皮；1.虎杖苷(306nm)；2.白藜芦醇(306nm)；3.大黄素(254nm)；4.大黄素甲醚(254nm)。图1 对照品及虎杖根皮样品色谱图

2.2 对照品溶液制备

精密称取各对照品适量，加50%乙醇溶解，配成质量浓度分别为虎杖苷(244.8 μg·mL-1)、白藜芦醇(41.0 μg·mL-1)、大黄素(130.2 μg·mL-1)、大黄素甲醚(43.8 μg·mL-1)的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

精密称取虎杖根皮、根木质部、根茎、叶、茎、枝粗粉各0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，密塞，静置30 min，称定质量，回流提取60 min，取出，放冷，密塞后再次称定质量，以50%乙醇补足减失的重量，摇匀，离心(10 000 r·min-1)10 min，取上清液2 mL作为供试品溶液A，用于测定二苯乙烯类和游离蒽醌类化合物。必要时供试品溶液可加50%乙醇稀释后测定。

另精密吸取上述离心所得上清液10 mL，置具塞锥形瓶中，加2.0 mL浓盐酸，摇匀，回流水解60 min，取出，放冷，转移至25 mL量瓶中，以50%乙醇定容，摇匀，作为供试品溶液B，用于测定总蒽醌。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察及检测限和定量限测定 分别精密吸取2.2项下制备的对照品溶液，加50%乙醇依次稀释成不同浓度的系列溶液，进样10 μL，按2.1项下色谱条件检测，以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程(见表1)。最低检测限(LOD)与最低定量限(LOQ)分别在信噪比(S/N)为3和10时测定(见表1)。结果显示，所测定的4种成分在相应范围内均呈良好的线性关系，且其检测灵敏度相对较高。

表1 各对照品线性关系及LOD、LOQ

2.4.2精密度试验 取混合对照品溶液，按上述色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果显示，虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为1.2%、1.9%、1.3%和1.5%，表明其精密度良好。

2.4.3重复性试验 精密称取虎杖根粗粉0.2 g，6份，按照2.3项下方法制备供试品溶液，依法进样，分别记录虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚的峰面积，计算其质量分数及RSD值。结果显示，其质量分数RSD分别为1.7%、0.9%、0.7%、1.5%，表明本方法重复性良好。

2.4.4稳定性试验 精密称取1份虎杖根粗粉0.2 g，按照2.3项下方法制备供试品溶液，24 h内每隔2 h进样1次，记录峰面积并计算其RSD值。结果显示，虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD依次为2.8%、1.8%、1.7%和1.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5加样回收率试验 精密称取已知含量的虎杖根粗粉0.1 g，6份，分别加入等量对照品，依法制备供试品溶液并进样分析，计算回收率。结果显示，虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚平均回收率分别为98.1%、98.3%、100.5%和 99.1%，RSD值分别为2.3%、1.9%、2.3%和2.9%，表明所建立的提取方法准确可靠。

2.5 样品测定

分别精密吸取对照品溶液和虎杖不同部位样品供试品溶液，注入液相色谱仪，记录虎杖苷、白藜芦醇、大黄素及大黄素甲醚的峰面积，按外标法计算供试品中各成分的量，每个样品平行3次进样测定，以均值作为测定结果，且均以干燥品计。其中，供试品溶液A所测得的蒽醌类成分的量为样品中游离型蒽醌类成分的量；结合型蒽醌类成分的量=总蒽醌类成分的量(供试品溶液B)-游离型蒽醌类成分的量(供试品溶液A)。虎杖植株不同部位样品中二苯乙烯类和蒽醌类成分分析结果(表2)显示，虎杖植物中二苯乙烯类及蒽醌类资源性物质主要分布于地下根及根茎，并整体呈现出根、根茎、茎、枝、叶渐次减少的分布规律；两类成分在地下部位尤以根皮部位分布丰富，其二苯乙烯类成分虎杖苷、白藜芦醇含量分别达50.06、5.17 mg·g-1，游离大黄素和大黄素甲醚含量分别达5.75、0.38 mg·g-1，结合型大黄素和大黄素甲醚含量分别达5.26、0.43 mg·g-1，而其叶中均未检测到二苯乙烯类和游离蒽醌类成分。

表2 虎杖不同组织器官样品中活性成分分析结果(n=3) mg·g-1

注：“—”表示未检测到。

3 讨论

现有文献报道虎杖中二苯乙烯类和蒽醌类成分的测定，多为两类成分分别进行供试品溶液制备及色谱分离，分析时间较长且操作繁琐。据此，本研究参照文献方法[7]优化了以同一种供试品溶液制备方法在同一色谱条件下同时测定虎杖中以上两类成分的HPLC定量分析方法，并在此基础上优化建立了用于分别测定游离蒽醌类和结合蒽醌类成分的分析方法，且经系统适应性实验证实该方法可行。样品溶液制备过程中，分别考察了不同体积分数乙醇(30%～80%乙醇)作为提取溶剂，以及超声、回流不同提取方法，发现采用50%乙醇加热回流60 min提取，能够兼顾上述二苯乙烯类及蒽醌类成分的溶解性，使得目标成分的提取效率较高，且影响色谱分离干扰峰较少。

研究结果显示，虎杖植株中各部位两类主要成分分布差异较大，地下根及根茎部位两类成分含量显著高于地上茎叶，符合对虎杖传统入药部位的认识。分析结果显示，根皮中活性成分含量显著高于根木质部及根茎，因此可以药材含韧皮部的多寡作为判断虎杖药材优劣的依据之一。

此外，据初步测算，虎杖药材采收期其地上茎叶资源的生物量约为地下根及根茎的5～8倍，目前因无有效利用途径而废弃。因此，对其开发利用不仅可实现虎杖植物资源的有效利用，也可解决虎杖药材采收过程中茎叶资源废弃造成的环境污染。资源的利用价值在于其可利用物质的多用性和多宜性特点[8]。本研究结果提示，虎杖地上茎叶中蒽醌类及茋类成分含量相对较低，资源可利用性较差，但其是否含有其他可利用资源性物质，如糖类、蛋白及氨基酸类等营养物质，本研究尚未涉及，因此尚需遵循中药资源化学的研究思路与方法[8]，在此基础上进一步开展其他多类型资源性化学成分研究，以充分揭示虎杖植物的资源价值，实现其综合、高效利用，最终为虎杖资源绿色产业链的构建提供支撑。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：208-209.

[2] 樊慧婷，丁世兰，林洪生.中药虎杖的药理研究进展[J].中国中药杂志，2013，38(15)：2545-2548

[3] Bralley E E，Greenspan P，Hargrove J L，et al.Topical anti-inflammatory activity of Polygonum cuspidatum extract in the TPA model of mouse ear inflammation[J].Journal of Inflammation，2008，5：1-7.

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[8] 段金廒.中药资源化学-理论基础与资源循环利用[M].北京：科学出版社，2015.

AnalysisofStilbenesandAnthraquinoneinDifferentPartsofPolygonumcuspidatum

HUANGXingyu，GUOSheng*，ZHUShaoqing，YANHui，QIANDawei，DUANJin’ao*

(JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization；StateAdministrationofTraditionalChineseMedicineKeyLaboratoryofChineseMedicinalResourcesRecyclingUtilization；NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To analyze the chemical constituents of stilbenes and anthraquinones in different tissues and organs (leaves，stems，shoots，rhizomes and roots) ofPolygonumcuspidatumSieb.et Zucc，and provide data for the comprehensive utilization ofP.cuspidatumresources.MethodsThe contents of stilbenes (polydatin，resveratrol)，free anthraquinones (emodin，emodin) and conjugated anthraquinones in different tissues and organs ofP.cuspidatumwere determined by HPLC.ResultsThe results showed that stilbenes and anthraquinones contained inP.cuspidatumwere mainly distributed in underground roots and rhizomes，especially in the root bark，and their contents exhibited a gradually decreasing trend from roots to rhizomes，stems，branches and leaves.Most of these analytes appeared the highest levels in the root bark，where the contents of polydatin，resveratrol，free emodin and physcion，conjugated emodin and physcionare 50.06，5.17，5.75，0.38，5.26 and 0.43 mg·g-1，respectively.ConclusionThe distribution organs of the stilbenes and anthraquinones inP.cuspidatumwas limited，and the results could provide data support for the comprehensive utilization ofP.cuspidatum.

Polygonumcuspidatum；non-medicinal parts；analysis and evaluation；stilbenes；anthraquinones

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.006

国家自然科学基金面上项目(81473538)；教育部霍英东教育基金会高等院校青年教师基金项目(141040)；公益性行业科研专项(201407002)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(ysxk-2014)

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郭盛，博士，副研究员，研究方向：中药资源化学与资源循环利用，E-mail：guosheng@njucm.edu.cn；段金廒，教授，博士生导师，中国自然资源学会中药及天然药物资源研究专业委员会主任委员，中国中药协会中药资源循环利用专业委员会主任委员，研究方向：中药资源化学与资源循环利用，E-mail：dja@njucm.edu.cn

2017-10-02)