嫁接陆地棉查尔酮合成酶与查尔酮异构基因的克隆及表达分析

宋成攀+夏松波+王孝刚+张教海+秦鸿德+张友昌+冯常辉+别墅

摘要：从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）HM-40中克隆了查尔酮合成酶GhCHS和查尔酮异构酶GhCHI基因。GhCHS基因的开放阅读框全长为1 170 bp，编码389个氨基酸，查尔酮合成酶含有较多的磷酸化位点，推测激酶磷酸化可能与其功能的行使相关，进化分析表明查尔酮合成酶与可可（Theobroma cacao）的CHS蛋白相似性最高；GhCHI基因的開放阅读框全长为630 bp，编码209个氨基酸，查尔酮异构酶含有较多的磷酸化位点，推测激酶磷酸化可能与其功能的行使相关，进化分析表明查尔酮异构酶与红麻（Hibiscus cannabinus）的CHI蛋白相似性最高。qRT-PCR分析显示，在接种大丽轮枝菌VD07菌系后，这两个基因表达量逐渐增加，随着接菌处理时间的延长，相对表达量增加，推测它们在陆地棉抗黄萎病防卫反应中可能起重要作用。利用VIGS技术在嫁接棉中成功地沉默GhCHS基因和GhCHI基因，对沉默棉株接种大丽轮枝菌VD07，鉴定显示其病情指数分别为72.5和67.5，表现为感病；而转化空载体和未沉默的嫁接棉棉株的病情指数分别为30.0和31.2，表现为耐病，基因沉默后嫁接棉对黄萎病的抗性丧失。表明GhCHS基因和GhCHI基因在陆地棉抗黄萎病的过程中可能起重要作用。

关键词：棉花（Gossypium hirsutum L.）嫁接；查尔酮合成酶和查尔酮异构酶；黄萎病；VIGS

中图分类号：S562 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）23-4616-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.050

Abstract： Two new genes，GhCHS and GhCHI，were cloned from cotton（Gossypium hirsutum L.） cultivar HM-40，which were selected by iTRAQ of sea-land grafting cotton. The GhCHS open reading frame（ORF） was 1 170 bp and encoded a protein of 389 amino acids. Many phosphorylation sites were found in GhCHS protein， which suggested that the function of GhCHS is related to phosphorylation of these sites. The cloned gene was most closely related to Theobroma cacao CHS protein by phylogenetic analysis. The GhCHI open reading frame was 630 bp and encoded a protein of 209 amino acids. Many Phosphorylation sites were found in GhCHI protein，which suggested that the function of GhCHI is related to phosphorylation of these sites. The cloned gene was most closely related to Hibiscus cannabinus CHI protein by phylogenetic analysis. Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction showed that the two genes were rapidly activated after inoculation with Verticillium dahliae. When time prolonged，genes relative expression always increased. It was assumed that GhCHS and GhCHI might play an important role in the defense reaction against Verticillium wilt. Virus induced gene silencing was used to silence endogenous genes in resistant upland cotton by sea-land grafting cotton targeting a fragment of GhCHS or GhCHI. VD07 was used to inoculate silenced cotton plants to identify disease resistance. The results showed that the disease indices of wild type vector control and sea-land grafting cotton plants were 30.0 and 31.2，respectively. The disease index of silenced GhCHS plants was 72.5，GhCHI plants was 67.5. These results confirmed that the GhCHS gene and GhCHI might relate to Verticillium wilt resistance in cotton.

Key words： cotton（Gossypium hirsutum L.） grafting；GhCHS and GhCHI；Verticillium wilt；VIGSendprint

棉花（Gossypium hirsutum L.）是一种重要的经济作物，棉花生产关系到国家的经济发展和人民生活[1]，但是棉花黄萎病（Verticillium wilt）发生严重[2]。为了提高棉花的质量和产量，棉花黄萎病抗病性的研究受到广泛重视。研究棉花在大丽轮枝菌侵袭下产生防御过程，有利于阐明棉花在抗黄萎病方面的相关途径，寻找到相关的重要抗病基因，同时对大丽轮枝菌胁迫应答调控机制进行阐明，也将为棉花高抗分子育种提供理论依据。

查尔酮合成酶和查尔酮异构酶都是植物次生代谢过程中黄酮类分子合成的关键酶，合成查尔酮和查尔酮异构体，这些物质经过衍生会生成多种黄酮类物质，在众多生理生化过程中发挥重要作用，已经成为抗病抗逆研究和分析的重点[3，4]。查尔酮合成酶与异构酶在植物的苯丙氨酸代谢过程以及植物的成长过程中起重要作用，如植物的抗病能力[5，6]。很多植物的适应能力和忍耐力都比较强，能够在受到多种威胁的情况下积极地作出相应的应答，使得相应的基因得到有效地激发，产生相应的防御反应。研究者使用玉米小斑病病菌（Bipolaris maydis）侵染高粱的萌芽，发现CHS基因表达量显著增多，低抗性品种的表达量比高抗性的品种少得多，并且在持续时间上也短一些[7]。研究发现，查尔酮异构酶在调节黄酮类化合物的代谢过程中起一定作用[8]。

目前，棉花的抗黄萎病研究主要集中在生理生化特性、抗病基因的克隆、抗病蛋白鉴定和基因组表观遗传学等方面。通过对受大丽轮枝菌诱导表达的基因进行研究，就是一种研究抗病信号通路的方式，借此来研究棉花对黄萎病产生抗性的途径[9]。本研究克隆了陆地棉基因GhCHS和GhCHI完整的ORF，进行生物信息学预测，对嫁接棉接种大丽轮枝菌后不同时间的表达分析，并利用VIGS技术分别沉默这两个基因后，调查抗病指数，以期为更深入地研究其功能提供参考[10]。

1 材料和方法

1.1 试验材料及处理

试验材料是陆地棉感病品种HM-40，海岛棉高抗品种海7124，由武汉大学生命科学学院实验室鉴定保存，棉苗长至第二片真叶展开时（约1元硬币大小）嫁接，海岛棉为砧木，陆地棉为接穗。待嫁接成活后7 d接种强力致病菌VD07（中国农业科学院棉花研究所国家棉花生物学重点实验室朱荷琴提供），每株接菌20 mL，浓度为107个/mL，接菌方法采用伤根法，分别取0、2、4、6、8、10 d的棉花真叶，液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱待用。

参照Gao等[11]转化棉花的技术方法，在嫁接成活后7 d利用VIGS（Virus induced gene silencing）技術研究基因功能。分别注射接种农杆菌pYL-156-pYL-192和pYL-156-GhCHS-pYL-192、pYL-156-GhCHI-pYL-192，在VIGS处理16 d后取嫁接棉真叶，液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱待用。在农杆菌转化16 d后接种大丽轮枝菌VD07。每株接菌20 mL，浓度为107个/mL，采用伤根法，接菌25 d后调查病情指数。

DP441植物RNA快速提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司，PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒和pMD18-T载体购自TAKARA（大连）生物科技有限公司，OMEGA的E.Z.N.A.？誖 Cycle Pure Kit纯化试剂盒、EsTaq mix、大肠杆菌感受态Top 10购自武汉欧瑞文生物科技有限公司，Kod plus neo高保真聚合酶购自TOYOBO（上海）生物科技有限公司，GV3101农杆菌感受态实验室自制，烟草脆裂病毒沉默载体pYL-192、pYL-156由清华大学刘玉乐教授馈赠。

1.2 总RNA提取及cDNA制备

用DP441植物RNA快速提取试剂盒提取总RNA，然后用TAKARA PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒将棉花真叶总RNA反转录成第一链cDNA。

1.3 GhCHS和GhCHI基因的克隆

采用Oligo 7设计合适的引物。以GhCHS-F（5AGCATAGCAGCTTAGTCCA 3）和GhCHS-R（5 AACTGAATAGGCGTTAAGCTTC 3）为引物，用kod plus neo进行基因的扩增。PCR程序为94 ℃预变性，5 min；98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，28个循环；后延伸68 ℃，10 min，4 ℃结束反应。同样以GhCHI-F（5 CTTGCCTGCCTTAAACCTC 3）和GhCHI-R（5 TCATTTTGGGCTTCACTCA 3）为引物，扩增产物于1%的琼脂糖水平凝胶中电泳检测。PCR产物纯化使用Omega PCR产物纯化试剂盒，严格按照说明进行操作。然后采用pMD18-T连接，转化大肠杆菌感受态细胞Top 10，倒置培养过夜。挑取单克隆进行菌液PCR检测，并且测序进行验证。测序由苏州金维智科技有限公司完成。

1.4 GhCHS和GhCHI基因的VIGS载体的构建

设计VIGS引物，以pYL-156-CHS-F（5 CGC GGATCCAGCATAGCAGCTTAGTCCA 3）和pYL-156-CHS-R（5 CCGCTCGAGAACTGAATAGGCG TTAAGCTTC 3）为引物（下划线部分为保护碱基和酶切位点），用LA Taq进行基因的扩增。PCR程序为94 ℃预变性，5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；后延伸72 ℃，10 min，4 ℃结束反应。同样以pYL-156-CHI-F（5 CGCGGATCCCTTGCCTGCCTTAAACCTC 3）和pYLendprint

-156-CHI-R（5 CCGCTCGAGTCATTTTGGGCTTCA

CTCA 3）为引物（下划线部分为保护碱基和酶切位点），扩增产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳检测。PCR产物纯化使用Omega PCR产物纯化试剂盒，严格按照说明进行操作。然后进行酶切反应，同样酶切pYL-156质粒，solutionⅠ连接4 h，转化大肠杆菌感受态细胞Top 10，倒置培养过夜。挑取单克隆，进行菌液PCR检测，并且测序进行验证。测序由苏州金维智科技有限公司完成。

提取阳性质粒，用农杆菌感受态细胞GV3101电转，涂平板后28 ℃暗培养倒置培养过夜，挑取单克隆，进行菌液PCR检测。挑取阳性的农杆菌克隆，分别为pYL-156-GhCHS、pYL-156-GhCHI。具体VIGS方法参照Gao[11]。

1.5 克隆基因序列的生物信息学分析

使用在线软件Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）和PSORT（http：//www.genscript.com/psort.html）分析这2个蛋白质的理化性质以及进行亚细胞定位的预测。采用SignalP 4.1分析蛋白质是否含有信号肽。采用TMHMM预测跨膜螺旋。然后在NCBI上的protein blast进行氨基酸同源序列比对，采用MEGA 5软件对其他植物GhCHS和GhCHI蛋白质构建系统发生树。应用NetPhos 2.0程序预测磷酸化位点。

1.6 GhCHS和GhCHI基因表达量分析

按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒的说明书，采用qRT-PCR分析GhCHS和GhCHI基因的相对表达量。扩增目标基因引物为qCHS-F（5 TTCAACCATTGGGCATAT CCG 3）和qCHS-R（5 ACTCTGAAAGAACGTGCC TTG 3）、qCHI-F（5 CCATTTTCCAGCAAATTCAGC 3）和qCHI-R（5 TTTCTTGATCATCTCGACCAC 3）；内参基因引物为actin-F（5 TCACGGAA GCACCTCTCAAC 3）和actin-R（5 ACAAAGAGA GAACGGCCTGG 3），每个样品3次技术重复和3次生物学重复，使用Bio-Rad CFX96 Manager荧光定量仪进行，按照2^-ΔΔCt法计算相对表达量。qRT-PCR程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，57 ℃退火延伸20 s，40个循环；65～95 ℃，每步增加0.5 ℃，5 s；做溶解曲线以确定扩增产物的特异性延伸5 s。

1.7 VIGS研究GhCHS和GhCHI基因功能的半定量和qRT-PCR分析

按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒的说明书，将反转录的cDNA原液稀释10倍，半定量分析，用引物V-bCHS-F（5 TTGGATGAGATGAGGAA 3）和V-bCHS-R（5 CA

AAGTAACTTATTATTGCC 3）、V-bCHI-F（5CTGT

GAGGGACCGATTG 3）和V-bCHI-R（5 TGGCAT

TTTCATTTTGG 3），内参基因引物为actinB-F（5G

TTATGGTTGGGATGGG 3）和actinB-R（5 CAAGG

TCAAGACGGAGG 3），PCR程序为94 ℃预变性，5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，分别扩增20、25、28、31、32、33、34、35、36、37、38个循环；延伸72 ℃，10 min，4 ℃结束反应。扩增产物于1%的琼脂糖水平凝胶中电泳检测。

采用qRT-PCR 分析GhCHS和GhCHI基因的相对表达量。扩增目标基因引物为V-qCHS-F（5 T

TTTACCATTCATAGCATAG 3）和V-qCHS-R（5 T

ACGGAAATAGTAGTCAGG 3）、V-qCHI-F（5 ACA

AGGGGAGTGTCTGC 3）和V-qCHI-R（5 TGGCA

TTTTCATTTTGG 3）；内参基因引物为actin-F（5 T

CACGGAAGCACCTCTCAAC 3）和actin-R（5 ACA

AAGAGAGAACGGCCTGG 3），qPCR方法同上。

2 结果与分析

2.1 陆地棉基因GhCHS和GhCHI的克隆

以反转录得到的陆地棉cDNA为模板，以GhCHS-F（5 AGCATAGCAGCTTAGTCCA 3）和GhCHS-R（5 AACTGAATAGGCGTTAAGCTTC 3）為引物，获得了1 400 bp左右的阳性条带（图1），测序结果见图2，显示其ORF全长为1 170 bp。同样以GhCHI-F（5 CTTGCCTGCCTTAAACCTC 3）和GhCHI-R（5 TCATTTTGGGCTTCACTCA 3）为引物，获得了800 bp左右的阳性条带（图1），测序结果见图3，显示其ORF全长为630 bp。

2.2 GhCHS蛋白质和GhCHI蛋白质的理化性质

2.2.1 GhCHS蛋白质的理化性质 使用在线软件Protparam分析蛋白质的理化性质，分析GhCHS蛋白质，其分子式是C1 900H3 045N507O563S19，其等电点约是6.12，其分子量约是42.608 ku。其氨基酸数目结果见表1，含量较多的氨基酸是Leu、Val、Ala、Gly、Glu、Lys，其中呈负电荷的酸性氨基酸（Glu和Asp）有48个，呈正电荷的碱性氨基酸（Lys和Arg）有44个，表明这是个呈负电的酸性蛋白质。预测其不稳定指数为38.76，在体外的哺乳动物网织红细胞中表达时半衰期约30 h，在酵母中表达时半衰期超过20 h，在大肠杆菌中表达时半衰期超过10 h，蛋白质表现稳定。endprint

2.2.2 GhCHI蛋白质的理化性质 使用在线软件Protparam分析蛋白质的理化性质，分析GhCHI蛋白质，其分子式是C1 059H1 662N262O322S5，其等电点约是4.86，其分子量约是23.377 ku。其氨基酸数目结果见表2，含量较多的氨基酸是Glu、Val、Lys、Ala、Leu、Thr，其中呈负电荷的酸性氨基酸（Glu和Asp）有34个，呈正电荷的碱性氨基酸（Lys和Arg）有22个，表明该蛋白质是呈负电的酸性蛋白质。预测其不稳定指数为35.39，在体外的哺乳动物网织红细胞中表达时半衰期约30 h，在酵母中表达时半衰期超过20 h，在大肠杆菌中表达时半衰期超过10 h，蛋白质表现稳定。

2.3 GhCHS蛋白和GhCHI蛋白的亲疏水性和亚细胞定位预测

2.3.1 GhCHS蛋白的亲疏水性和亚细胞定位预测 使用蛋白质的亲疏水性预测在线软件ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/），将GhCHS蛋白质的氨基酸序列输入，分析结果见图4，GhCHS蛋白质的亲水性平均系数（GRAVY）是-0.096，表明整个蛋白质呈亲水性。再将GhCHS蛋白质的氨基酸序列输入到在线分析软件PSORT进行亚细胞定位预测，结果显示GhCHS蛋白质可能定位于细胞质（得分0.450）、过氧化物酶体（得分0.300）、线粒体基质（得分0.100）和溶酶体（得分0.100）；使用SignalP 4.1软件分析GhCHS蛋白质的有无信号肽序列，结果显示GhCHS蛋白质无信号肽序列，那么该蛋白质无法进行跨膜运输；使用TMHMM预测该蛋白质的跨膜结构域，结果显示该蛋白质没有跨膜螺旋区。根据以上预测，推断GhCHS蛋白质是一种亲水性的细胞质蛋白质。

2.3.2 GhCHI蛋白质的亲疏水性和亚细胞定位预测 运用蛋白质亲疏水性预测在线软件ProtScale，将GhCHI蛋白质的氨基酸序列输入后分析，其预测结果见图5，GhCHI蛋白质的亲水性平均系数（GRAVY）是-0.153，即整个蛋白质呈亲水性。运用在线分析软件PSORT（亚细胞定位预测），再将GhCHI蛋白质的氨基酸序列输入，预测结果为GhCHI蛋白质定位可能在细胞质（分值0.450）、过氧化物酶体（分值0.206）、溶酶体（分值0.100）与线粒体基质（分值0.100）；使用SignalP 4.1软件分析GhCHI蛋白质的信号肽情况，发现该蛋白质无信号肽序列，无法跨膜运输；使用TMHMM预测该蛋白质的跨膜结构域，预测该蛋白质没有跨膜螺旋区。根据以上预测，推断GhCHI蛋白质是一种亲水性的细胞质蛋白质。

2.4 GhCHS蛋白质和GhCHI蛋白质的同源比对和系统进化树分析

2.4.1 GhCHS蛋白质的同源比对和系统进化树分析 采用BlastP进行同源性分析，发现陆地棉GhCHS的氨基酸序列与其他物种的该蛋白质具有很高的序列相似性。选取12个代表性物种，如可可（Theobroma cacao，XP_007034442.1）、红麻（Hibiscus cannabinus，AIC75908.1）、猕猴桃（Actinidia chinensis，AGV53049.1）、山茶（Camellia japonica，BAI66465.1）、甜樱桃（Prunus avium，AJO67963.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，NP_196897.1）、土豆（Solanum tuberosum，AEN83501.1）、水稻（Oryza sativa Japonica Group，NP_001068009.1）、梨（Pyrus pyrifolia，AFQ92052.1）、盐肤木（Rhus chinensis，AGH13332.1）、莲藕（Nelumbo nucifera，ADD74167.1）和苹果（Malus domestica，BAB92996.1）等，采用MEGA 5.0软件，同源序列比对结果（图6）显示，氨基酸序列相似性很高。进化树结果（图7）显示，陆地棉的GhCHS蛋白质与可可的XP_007034442.1进化关系较近。

2.4.2 GhCHI蛋白质的同源比对和系统进化树分析 用BlastP进行同源性分析，发现陆地棉GhCHI的氨基酸序列与其他物种的该蛋白质具有很高的序列相似性。选取13个代表性物种，如可可（Theobroma cacao，XP_007011312.1）、红麻（Hibiscus cannabinus，AIC73814.1）、猕猴桃（Actinidia chinensis，AGV53050.1）、梨（Pyrus pyrifolia，AFQ92051.1）、金花猕猴桃（Actinidia chrysantha，AIY53017.1）、余甘子（Phyllanthus emblica，AHA61355.1）、山竹（Garcinia mangostana，ACM62743.1）、忍冬（Lonicera japonica，AGE10598.1）、黑果枸杞（Lycium ruthenicum，AHH86093.1）、花生（Arachis hypogaea，AEO17326.1）、浦竹仔（Indosasa hispida，AHC07954.1）、枸杞（Lycium chinense，AIC33515.1）和桑（Morus alba，ALD83622.1）等，采用MEGA 5.0 軟件，同源序列比对结果（图8）显示，氨基酸序列相似性很高，说明该蛋白质在进化上比较保守。进化树结果（图9）显示，陆地棉的GhCHI蛋白质与红麻的AIC73814.1 进化关系较近。

2.5 GhCHS蛋白质和GhCHI蛋白质的磷酸化位点预测

2.5.1 GhCHS蛋白质的磷酸化位点预测 蛋白质磷酸化是蛋白质修饰的一种方式，在真核生命活动中非常重要，参与并调控着许多细胞活动。蛋白质磷酸化修饰后，会改变蛋白质的构象、稳定性、活性以及在细胞中所处的位置[12]。GhCHS蛋白质含有24个苏氨酸和22个丝氨酸，潜在的磷酸化位点较多。运用蛋白质磷酸化位点预测在线软件NetPhos 2.0，预测结果见图10，预测GhCHS蛋白质潜在苏氨酸（Thr）磷酸化位点6个，潜在丝氨酸（Ser）磷酸化位点9个，潜在酪氨酸（Tyr）磷酸化位点2个。预测GhCHS蛋白质磷酸化位点17个，推测GhCHS蛋白质的功能与激酶磷酸化相关。endprint

2.5.2 GhCHI蛋白质的磷酸化位点预测 GhCHI蛋白质含有15个苏氨酸和10个丝氨酸，潜在的磷酸化位点较多。使用在线软件NetPhos 2.0分析该蛋白质，分析结果见图11，预测潜在的苏氨酸（Thr）磷酸化位点3个，潜在的丝氨酸（Ser）磷酸化位点3个，潜在的酪氨酸（Tyr）磷酸化位点2个。预测的GhCHI蛋白质磷酸化位点8个，推测GhCHI蛋白质功能与激酶磷酸化相关。

2.6 GhCHS和GhCHI基因在大丽轮枝菌VD07胁迫下的相对表达量

利用qRT-PCR方法分析GhCHS和GhCHI基因在嫁接棉（7124为砧木，HM-40为接穗）真叶中的相对表达量，结果（图12）显示，GhCHS和GhCHI基因在接种大丽轮枝菌VDO7菌系后，这2个基因表达量逐渐增加，随着接菌处理时间的延长，相对表达量增加，GhCHS基因随着接菌处理时间的增加，其表达量逐渐增加，且第二、四、六、八、十天与未接菌的0 d相比，都存在显著差异（P<0.05），在第十天时，该基因的表达量上调了约39倍；GhCHI基因随着接菌处理时间的增加，其表达量逐渐增加，且第二、四、六、八、十天与未接菌的0 d相比，都存在显著差异（P<0.05），在第十天时，该基因的表达量提高了约14倍，推测它们在嫁接棉抗黄萎病防卫反应中可能起重要作用。

2.7 利用VIGS技术研究GhCHS和GhCHI基因的功能

在接种农杆菌16 d后分别取接种空载体pYL-156-pYL-192和pYL-156-GhCHS-pYL-192、pYL-156-GhCHI-pYL-192的棉叶样品提取总RNA，进行RT-PCR；然后进行半定量试验（图13）和qRT-PCR试验，发现接种带目的基因载体的比接种带空载体的基因表达量分别下降84.74%和87.86%（图14）。对未接农杆菌处理嫁接棉、转化空载体嫁接棉和基因沉默嫁接棉接大丽轮枝菌后25 d调查结果表明，未接农杆菌嫁接棉病情指数为31.2，表现为耐病；转化空载体嫁接棉病情指数为30.0，表现为耐病；基因沉默嫁接棉病情指数分别为72.5和67.5，表现为感病（图15）。

3 讨论

随着植物基因工程研究的深入，以及新技术的开发，生物信息学的不断发展，植物的许多基因被克隆，并且研究者快速地进行功能预测和分析，特别是VIGS技术的应用，许多基因的功能可以快速检测，通过转录后对基因进行沉默，导致基因不被翻译成蛋白质，达到RNAi效果，加快了对基因功能的研究。查尔酮合成酶和查尔酮异构酶是植物合成类黄酮的关键酶，植物细胞中的多种与发育生长、抗病抗逆相关的次生代谢过程都与这一途径有关，都参与了植物的防御反应。对于棉花抗黄萎病相关的研究中，关于这类酶的研究并不多。

本研究克隆陆地棉的GhCHS和GhCHI基因后，通过生物信息学分析预测，GhCHS和GhCHI蛋白质均为亲水性细胞质蛋白质，且GhCHS和GhCHI蛋白质均含有较多的磷酸化位点，推测激酶磷酸化可能与其功能的行使相关，另外这两个基因均受大丽轮枝菌胁迫诱导表达，很可能与植物抗病防御反应有关。本实验室已经构建了病毒沉默载体，并转化了棉花植株，发现这两种基因无论哪一个丧失功能，均会导致棉花抗黄萎病抗性的丧失，进一步表明了这两个基因的生物学功能，即可能参与了棉花的抗病防御反应，为更深入地研究这两个基因的功能以及研究棉花抗黄萎病相关途径提供理论支持。

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