非洲菊嫩叶愈伤组织诱导和增殖因素研究

过聪+张庆华+向发云+曾祥国+韩永超+董欢+顾玉成

摘要：以非洲菊（Gerbera jamesonii）嫩叶为材料，研究了不同外植体部位、暗培养条件、培养基激素等因素对非洲菊愈伤组织诱导和增殖的影响。结果显示，非洲菊叶片边缘切口出愈伤速度快于叶柄伤口；带叶基叶柄出愈伤率最高，诱导培养15 d出愈伤率为84%以上；叶柄上诱导的愈伤团生长最快，15 d愈伤生长量在82%以上。愈伤组织诱导期间使用暗培养能降低外植体死亡率，并一定程度上提高愈伤生长量，但显著降低了外植体诱导出愈伤率和愈伤质量。愈伤增殖培养最适培养基为MS+TDZ 1.5 mg/L+2，4-D 0.30 mg/L，20 d内愈伤增殖量达到76%以上，有效降低了愈伤组织褐化死亡率，且愈伤组织状态良好。

关键词：非洲菊（Gerbera jamesonii）；愈伤组织；带叶基叶柄；暗培养

中图分类号：S682.1+1；S339.4+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）23-4545-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.032

Abstract： The effects of different explant parts，darkness plans and hormones on callus induction and proliferation were studied with unfolded leaf materials in Gerbera jamesonii. The results showed that the callus induction of blade explants was faster than petiole explants. Callus induction rate of winged petiole in 15 days was higher than 84%，while unwinged petiole explants had a highest callus growth rate of over 82%. Using darkness in callus induction had adverse effects on callus induction and quality，though a good for callus volume growth. MS+TDZ 1.5 mg/L+2，4-D 0.30 mg/L was the best medium for callus proliferation，with a callus proliferation rate higher than 76% in 20 days，and good callus tissues with lower death rate from browning as well.

Key words： Gerbera jamesonii； callus tissue； winged petiole； darkness culture

非洲菊（Gerbera jamesonii）為菊科大丁草属宿根草本花卉，是国际上广泛培育的重要观赏花卉，为世界五大鲜切花之一。非洲菊传统上以杂交育种和分株繁殖为主，由于传统育种手段繁殖系数低、后代性状不稳定等原因，早在20世纪70年代开始，国内外相继开展了非洲菊离体快繁研究[1]。目前市场上出现的非洲菊离体快繁以非洲菊茎尖、叶柄直接出芽为主[2-4]。非洲菊不同部位外植体的离体再生能力各异，其中叶片、花托、花梗等外植体更容易先诱导出愈伤组织再分化成芽[5]。近年来随着非洲菊市场需求的不断扩大，不少研究者针对非洲菊的愈伤组织再生途径展开了研究[6-8]。在再生途径中采用愈伤组织不但能进一步提高非洲菊快繁频率，在非洲菊细胞工程和基因工程育种中也能提高转化效率，并有效降低嵌合体发生率[9，10]。叶片及其叶柄部位作为非洲菊营养器官，相比于非洲菊的花器官材料，其生长量大且取材方便。为此，试验在前期的研究基础上，以非洲菊嫩叶为外植体，对其愈伤组织的诱导条件、外植体取材部位等因素进行了研究，并筛选了非洲菊愈伤组织增殖过程中培养基附加激素噻苯隆（TDZ）和2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）的最佳配比方案，以期获得非洲菊嫩叶诱导愈伤的优化方案，为非洲菊离体快繁提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试非洲菊（Gerbera jamesonii）为湖北省农业科学院经济作物研究所大棚内苗床中种植的无病虫害非洲菊“水粉”母株。取初展开的带叶柄嫩叶作为试验材料。取样季节为夏季，棚内平均最高日温为30 ℃。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒 试验材料取回后剪去叶柄基部，并按部位分为叶柄、带叶基叶柄和叶片，用稀释了100倍的84消毒液涡旋浸泡15 min，然后于自来水下冲洗干净。材料洗净后在超净工作台上用75%的乙醇浸泡30 s，再用0.1%升汞灭菌12 min，无菌水洗4～5遍后置于无菌吸水纸上晾干材料上的水分。

1.2.2 培养方案 将灭菌消毒后的叶片外植体在超净工作台内以叶脉为中心切割成8 mm×8 mm左右的小块，叶柄切成8 mm长大小，并接种于愈伤诱导培养基上，具体配方为MS基础培养基+TDZ 2 mg/L+2，4-D 0.05 mg/L，分别放置于黑暗环境或者14 h/10 h光周期中培养，光照度为2 000 lx，培养温度为（25±1） ℃。每瓶接种叶片外植体4块，或接种叶柄（或带叶基叶柄）2块。愈伤组织继代增殖培养基均使用MS基础培养基，附加30 g/L蔗糖和6 g/L琼脂，培养基pH为5.8。在愈伤诱导一个月后开始非洲菊愈伤增殖培养。将愈伤团切成大小一致的初始愈伤团，每瓶接种6～8个愈伤团。非洲菊愈伤组织增殖培养基的激素配比见表1。其中培养基A与非洲菊愈伤诱导培养基配方相同。

1.2.3 统计方法 每天观察外植体，记录愈伤组织初次出现时间。愈伤组织诱导试验中，分别统计3种暗培养方案下叶片、带叶基叶柄和叶柄总个数以及培养15 d时外植体的出愈伤率和愈伤组织长势。外植体出愈伤率=出愈伤外植体数/总外植体数×100%。

统计愈伤团在外植体材料上的体积占比，将诱导出的愈伤组织体积比分为四个等级：Ⅰ-已出愈伤组织占诱导材料总体积的1/4及以下；Ⅱ-已出愈伤组织占诱导材料总体积的1/4～1/2；Ⅲ-已出愈伤组织占诱导材料总体积的1/2～3/4；Ⅳ-已出愈伤组织占诱导材料总体积的3/4～1，即外植体几乎已被愈伤团完全包裹。诱导出的愈伤组织总体积比=（0.25×Ⅰ中的外植体数+0.5×Ⅱ中的外植体数+0.75×Ⅲ中的外植体数+1×Ⅳ中的外植体数）/（1×总外植体个数）×100%。

使用千分天平称量愈伤组织质量。其中，初始愈伤团的质量通过随机抽取切好的愈伤团29团进行测量后计算平均值得出；在愈伤增殖第20天随机抽取不同培养基中愈伤组织测量质量，愈伤团增殖率=（愈伤团增殖后质量-初始愈伤团质量）/初始愈伤团质量×100%。愈伤团褐化死亡率在愈伤增殖培养20 d时统计。

2 结果与分析

2.1 不同外植体部位对愈伤组织诱导的影响

試验中将叶片、叶柄分开培养，其中叶柄还分为带叶基叶柄段和不带叶基叶柄段。试验结果表明，叶片比叶柄更快速诱导出愈伤组织，叶片在诱导培养第5～6天开始出现皱缩，初次出愈伤时间为7～9 d，而叶柄切口处出愈伤时间为10 d以上。带叶基叶柄最先在叶片切口边缘诱导出初始愈伤。表2的统计结果显示，在愈伤诱导第15天时，3种外植体的愈伤组织诱导率都在40%以上，其中叶片和带叶基叶柄均在80%左右；愈伤组织生长量中最低的为叶片，另外两种材料的愈伤生长量均在60%以上。诱导愈伤团最多的是带叶基叶柄，愈伤团生长量最大的是叶柄诱导，其次为带叶基叶柄。总体来看，带叶基叶柄是进行愈伤组织诱导的最佳外植体材料。

2.2 暗培养对愈伤诱导的影响

研究愈伤组织培养中的环境条件，不但有利于愈伤组织的快速诱导，还能在工厂化生产中节省生产成本。试验中对非洲菊叶片、叶柄、带叶基叶柄的愈伤组织诱导过程进行了暗培养条件摸索。分别使用全光照、暗培养7 d和全暗培养培养外植体材料。对叶片外植体死亡数统计结果显示，无暗培养条件下由于褐化死亡的叶片外植体占比较大。

观察统计不同暗培养条件对外植体和愈伤诱导的影响，在培养第10天时有77%的外植体均已出愈伤组织，以叶片出愈伤为主。愈伤组织初次出现的时间受暗培养条件影响不大，而主要取决于外植体取材部位。于愈伤诱导培养15 d时统计出愈伤外植体数，计算出愈伤率和愈伤生长量（表3）。从表3可以看出，各外植体在无暗培养条件下出愈伤率最高，外植体的愈伤诱导能力随着暗培养时间的延长而减弱，长时间的全暗培养导致愈伤诱导率减少近50个百分点。此外，尽管暗培养条件能在一定程度上提升愈伤组织生长量，但从叶片外植体的培养结果看，暗培养下的叶片容易黄化，其产生的愈伤组织颜色以淡黄色、白色居多。

2.3 筛选愈伤增殖培养基

外植体在愈伤诱导培养基中培养一个月后基本全部诱导出愈伤组织。将状态良好、无污染的愈伤组织和带外植体残留组织的愈伤组织切成大小均一的小团，转入愈伤增殖培养基培养。愈伤组织增殖的快慢与多种因素有关，试验选用了3种不同浓度配比的TDZ和2，4-D进行愈伤组织增殖研究。对愈伤组织接种后的褐化率以及增殖速率进行了比较分析。

初始接种的愈伤组织体积大小基本一致，称量后平均质量为（0.117 5±0.004 6） g。在愈伤组织增殖第20天时记录愈伤团增殖质量和褐化死亡率，结果见表4。从表4可以看出，使用愈伤诱导培养基继续进行愈伤组织的增殖时，其愈伤增长缓慢，且更容易褐化死亡。而另外两种培养基对愈伤的增殖影响差异不大，愈伤组织20 d能增重76%以上，且褐化率相对于诱导培养基降低了约3个百分点。

从愈伤组织状态来看，培养基B中的愈伤团更紧密，呈绿色，而培养基C中所出愈伤团以白绿色为主（图1）。愈伤组织褐化率统计结果表明，3种培养基中褐化愈伤团主要为带外植体残留接种的愈伤团，而去除了残留外植体后的愈伤团能有效降低愈伤组织褐化率。

3 小结与讨论

近年来有关非洲菊愈伤诱导的研究主要集中在非洲菊的花托部位，而叶片及叶柄仅有少量文献报道[11-13]。叶片作为非洲菊的营养器官，取材方便且不受时间限制，本研究以非洲菊“水粉”的嫩叶为材料，探索了以非洲菊嫩叶不同部位为外植体诱导愈伤组织的差异，愈伤诱导结果综合显示，嫩叶作为愈伤诱导外植体，其最佳取材部位为带叶基的叶柄。该结论与周俊等[14]的研究结果一致，而与陈玉华等[15]的结果相异，究其原因，可能与非洲菊品种、愈伤诱导使用的培养基配方不同有关。

在大多数植物的愈伤组织诱导过程中，适当加以一段时间的暗培养可以延缓外植体褐化，降低外植体死亡率并提高外植体出愈伤率[16，17]。本研究中加以不同时长的暗处理尽管能减少外植体死亡率和提高愈伤组织的体积比，却不利于叶片、叶柄外植体的出愈伤率。说明光照能刺激外植体快速诱导出愈伤组织，该结果与非洲菊“大雪桔”品种的研究结果类似[18]，说明非洲菊嫩叶的愈伤组织诱导培养可以直接在光照条件下完成。

本研究中使用的愈伤诱导培养基添加了TDZ和2，4-D，叶片和叶柄均在15 d内出现愈伤，且愈伤体积占比较高。而在戴云新等[19]的研究中，以添加了6-苄氨基嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）的MS培养基为愈伤诱导培养基，叶片、叶柄在26 d后才出现愈伤，且愈伤量明显低于花托。该结果说明培养基中使用激素TDZ和2，4-D可能更适合非洲菊叶片、叶柄的愈伤诱导。非洲菊离体快繁中TDZ与2，4-D结合应用的研究较少，因此该激素组合对非洲菊嫩叶离体快繁的作用还有待深入研究。

植物生长调节剂TDZ在众多植物的愈伤组织诱导中充当着非常有效的细胞分裂素角色，但同时也给愈伤组织的生长状态带来含水量增高等改变，且过高浓度的TDZ能导致后期的愈伤分化培养受抑[20]。本研究结果表明，TDZ含量较高时能有效诱导非洲菊嫩叶外植体出愈伤，而高浓度的TDZ培养不适宜愈伤组织的长时间增殖，降低TDZ浓度能减少愈伤组织褐化死亡率，提高愈伤增殖能力并调整愈伤状态。国内外有关2，4-D在非洲菊愈伤诱导中的作用报道较少。在张素勤等[21]的研究中，2，4-D比NAA和吲哚丁酸（IBA）对非洲菊叶片愈伤组织的诱导更快，植物生长激素以1.0 mg/L的2，4-D诱导率最高，且形成愈伤组织最多，该结果与Mohlakola等[18]的结果一致。而本研究中使用的2，4-D激素浓度均不高，其与TDZ配合使用结果显示，低浓度的2，4-D配合TDZ可以快速诱导出叶片、叶柄愈伤，而其对愈伤组织增殖的作用效果还需进一步通过试验验证。

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