一株球形芽孢杆菌生产菌株的培养基优化研究

刘芳+廖先清+张志刚+周荣华+饶犇+张遵霞

摘要：利用单因素筛选和正交试验，对球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）NBIM-311高毒菌株的发酵培养基进行优化，得到其最佳培养基配方为鱼粉20.0 g/L，玉米浆15.0 g/L，花生粕60.0 g/L，酵母膏7.5 g/L，碳酸钙1.0 g/L，硫酸镁0.3 g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L。通过200 L和5 000 L发酵罐分别发酵，发酵液对致倦库蚊致死中浓度分别为0.963 mg/L和0.852 mg/L；发酵液经过后处理所制备的原粉对致倦库蚊致死中浓度分别为0.018 9 mg/L和0.022 3 mg/L。

关键词：球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）；致倦库蚊；培养基；优化

中图分类号：Q939.124 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）23-4516-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.024

Abstract： The fermentation medium for highly toxic Bacillus sphaericus strain NBIM-311 against Culex quinquefasciatus was optimized through single factor screening and orthogonal experiments. The optimum medium was composed of 20.0 g/L fish meal，15.0 g/L corn steep liquor，60.0 g/L peanut meal，7.5 g/L yeast extract，1.0 g/L Calcium carbonate，0.3 g/L Magnesium sulphate and 0.1 g/L Potassium dihydrophosphate. The pilot fermentation of the strain was successfully carried out in 200 L and 5 000 L fermentor，the LC50 of the fermentation broth were 0.963 mg/L and 0.852 mg/L respectively. The LC50 of the prepared raw powder obtained from post-treatment of the fermentation broth were 0.018 9 mg/L and 0.022 3 mg/L respectively.

Key words： Bacillus sphaericus； culex quinquefasciatus； medium； optimization

蚊虫是重要的传染病传播媒介，化学杀虫剂在蚊虫防治中发挥了重要作用[1]。随着蚊虫抗药性的发展及人们对环境安全的重视，研究者进行了生物杀蚊剂的开发，发现了两类重要的蚊虫病原细菌，苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis，简称Bti）[2]和球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）[3]。与苏云金芽孢杆菌以色列亚种相比，球形芽孢杆菌的杀蚊谱较窄，但其对库蚊属幼虫的毒性更强，且在污水中的药效维持时间较长，特别适用于污水中孳生的库蚊属幼虫（淡色库蚊和致倦库蚊）的控制[4，5]。中国目前已有球形芽孢杆菌BS-10及C 3-41等菌株实现了商品化，并开展了大面积的应用试验[6]。也有研究者对分离的球形芽孢杆菌的发酵培养基进行了优化[7，8]。球形芽孢杆菌的工业化生产受到其发酵水平的限制，目前应用还不是十分广泛。笔者在进行杀虫细菌的筛选研究中分离到一株对库蚊幼虫高毒的球形芽孢杆菌NBIM-311菌株，本试验主要选取来源广泛、价格便宜的农副产品作为原材料，对该菌株发酵培养基进行优化，以提高发酵水平。

1 材料与方法

1.1 菌株与材料

本试验所用的球形芽孢杆菌NBIM-311菌株由湖北省生物农药工程研究中心菌种室分离筛选并保藏；斜面活化培养基为常规牛肉膏蛋白胨培养基；单因素筛选原料为9种常见的市售农副产品：玉米粉、鱼粉、酵母粉、玉米浆、工业蛋白胨、蚕蛹粉、花生粕、豆粕、酵母膏；致倦库蚊4龄幼虫由湖北省生物农药工程研究中心养虫室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素筛选 根据球形芽孢杆菌的营养特性，不能利用葡萄糖、蔗糖等糖类物质，只能利用蛋白质、氨基酸等作为能源物质[9]，选取玉米粉、鱼粉、酵母粉、玉米浆、工业蛋白胨、蚕蛹粉、花生粕、豆粕、酵母膏作碳氮源，各原材料用量均为50.0 g/L，玉米浆用量按干物质含量折算，灭菌前pH 7.5，分装于500 mL三角瓶，每瓶装量25 mL，灭菌30 min。挑取一环菌苔接種于摇瓶中，置于旋转式摇床振荡培养，温度30～32 ℃，转速220 r/min，培养至芽孢40%分离时下摇床，发酵液进行镜检和生物测定。

1.2.2 正交试验 选取鱼粉、玉米浆、花生粕、酵母膏作碳氮源，进行4因素3水平正交试验（表1），无机盐保持不变，分别为碳酸钙1.0 g/L，硫酸镁0.3 g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L，按表1各浓度要求配制培养基，灭菌前pH 7.5，分装于500 mL三角瓶，每瓶装量25 mL，灭菌30 min。培养条件同“1.2.1”，发酵液进行镜检和生物测定。

1.2.3 200 L发酵罐发酵 按正交试验筛选到最佳培养基组分配制好培养基，投料体积120 L，消泡剂2.0 g/L，灭菌前pH 7.5，1×105 Pa灭菌30 min。待温度降至32 ℃时接入经80 ℃水浴20 min的孢子悬浮液，通气比1∶0.5～1.2，罐压0.5×105 Pa，培养温度30～32 ℃，发酵过程中取样镜检，芽孢40%分离时结束发酵。将发酵液pH调至4.5，过100目筛，台式离心机离心，3倍浓缩，所得菌浆冷冻干燥得到原粉，对发酵液和冻干粉进行生物测定。

1.2.4 5 000 L发酵罐发酵 按正交试验筛选到最佳培养基组分配制好培养基，投料体积3 000 L，消泡剂1.0 g/L，灭菌前pH 7.5，1×105 Pa灭菌30 min。待温度降至32 ℃时接入经80 ℃水浴20 min处理的孢子悬浮液，通气比1∶0.5～1.0，罐压0.5×105 Pa，培养温度30～32 ℃，发酵过程中取样镜检，芽孢40%分离时结束发酵。将发酵液pH调至4.5，过100目筛，碟片式离心机离心，3倍浓缩后的菌浆经高速离心式喷雾干燥机进行喷雾干燥，得到原粉，对发酵液和原粉进行生物测定。

1.2.5 生物测定 供试虫为致倦库蚊4龄幼虫，参照袁志明等[8]的方法进行生物测定。

2 试验结果与分析

2.1 单因素筛选

NBIM-311菌株在不同的碳氮源培养基中摇瓶发酵结果如表2。从表2中可以看出，鱼粉、玉米浆、花生粕、酵母膏均能被较好利用，其中花生粕同步率最高95%，菌體形态好，鱼粉、玉米浆其次，酵母膏同步率85%，菌体大小较一致，玉米粉、酵母粉、工业蛋白胨、蚕蛹粉、豆粕利用能力差，镜检极少量菌体。根据试验结果，选取鱼粉、玉米浆、花生粕、酵母膏作进一步试验的碳氮源物质。

2.2 正交试验

鱼粉、玉米浆、花生粕、酵母膏的L9（34）正交试验结果如表3和表4。从表3和表4方差分析结果表明，这4种原材料主效应排序为鱼粉>酵母膏>花生粕>玉米浆。鱼粉的F值为2.581，对发酵的影响最大，而玉米浆、花生粕对发酵的影响不是很大。确定最佳配方为鱼粉20.0 g/L，玉米浆15.0 g/L，花生粕60.0 g/L，酵母膏7.5 g/L，碳酸钙1.0 g/L，硫酸镁0.3 g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L。

2.3 200 L发酵罐发酵

发酵周期31 h，发酵21 h时取样镜检，孢囊形成率为95%，菌体大小整齐。放罐时取样镜检， 40%左右脱落，营养体少，芽孢大小整齐。将发酵液和冷冻干燥粉进行生物测定，发酵液对致倦库蚊的致死中浓度为0.963 mg/L，冷冻干燥粉对致倦库蚊的致死中浓度为0.018 9 mg/L。

2.4 5 000 L发酵罐发酵

在湖北康欣农用药业有限公司车间进行3个批次5 000 L罐发酵，离心浓缩，喷雾干燥得到原粉。分别对这3批发酵液和原粉取样进行生物测定，结果见表5。

3 小结与讨论

通过单因素碳氮源筛选和正交试验，获得NBIM-311菌株最佳培养基配方为鱼粉20.0 g/L，玉米浆15.0 g/L，花生粕60.0 g/L，酵母膏7.5 g/L，碳酸钙1.0 g/L，硫酸镁0.3 g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L。笔者在采用单因素试验时发现以花生粕作为碳氮源所得到的发酵液的毒力较高，与管玉霞等[10]的结果类似。采用该配方进行了200 L和5 000 L发酵罐试验，发酵液效价和经过后处理所得原粉效价均达到较高水平。但该菌株在200 L发酵罐中的发酵水平与其在5 000 L发酵罐的发酵水平存在差距，究其原因，笔者认为可能与发酵过程中中间控制工艺包括培养温度、通气量、搅拌转速以及后处理过程中的浓缩和干燥方法等有关。拟对该菌株的发酵工艺和后处理工艺技术的优化开展研究。

参考文献：

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