胶冻样芽孢杆菌发酵中试研究

廖先清+刘芳+周荣华+饶犇+陈伟

摘要：利用单因素筛选和正交试验，对胶冻样芽孢杆菌菌株NBF-266的发酵培养基进行了优化，得到其最佳培养基配方为甘油0.8%，淀粉0.6%，花生粕1.5%，碳酸钙0.1%。通过400 L和5 000 L发酵罐分别发酵，发酵液芽孢产量分别为18×108 CFU/mL和15.8×108 CFU/mL，发酵液经不同方式浓缩干燥，得到冻干粉和喷雾干燥粉芽孢产量分别为2 910×108 CFU/g和933×108 CFU/g。

关键词：胶冻样芽孢杆菌；芽孢产量；优化；中试生产

中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）23-4513-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.023

Abstract： The fermentation medium for Bacillus mucilaginous NBF-266 strain was optimized through single factor screening and orthogonal experiments. The composition of the optimized medium was glycerin 0.8%， starch 0.6%， peanut meal 1.5%， calcium carbonate 0.1%. Pilot production of B. mucilaginous was carried out in 400 L and 5 000 L fermentor， spore yield of the fermentation broth were 18×108 CFU/mL and 15.8×108 CFU/mL respectively. The fermentation broth was concentrated and dried in two different ways， spore yield of the freeze-dried powder and spray drying powder were 2 910×108 CFU/g and 933×108 CFU/g respectively.

Key words： Bacillus mucilaginous； spore yield； optimization； pilot production

微生物肥料是一类通过活体微生物发挥肥效的特殊肥料[1]。胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginous）是一种能分解硅酸盐矿物的特殊细菌，它因具有分解硅酸盐矿物、溶磷、解钾、固氮等和增强作物抗病能力等多种特点而被制成微生物肥料[2]，目前已广泛应用于各种农作物，增产效果明显[3]。但其生产工艺有待改变和提高，大多微生物肥料生产还在延续20世纪70和80年代的发酵后发酵液直接吸附或液体灌装的生产模式，无后处理工艺[4]，致使产品活菌数和芽孢形成率均较低，货架期也较短，增 产效果不稳定。

近年来关于胶质芽孢杆菌发酵条件多有研究，但针对该菌的中试发酵和浓缩干燥研究却鲜有报道。因此本研究拟通过一株胶质芽孢杆菌发酵培养基、工艺条件进行研究，并通过400 L小罐和5 000 L罐进行中试验证，获得可产生高密度活菌数和高芽孢率的发酵和浓缩干燥工艺，从而提高微生物菌肥产品中的有效活菌数和芽孢率，延长货架期，改善微生物肥料的质量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 供试胶冻样芽孢杆菌菌株NBF-266由湖北省生物农药工程研究中心实验室分离并保存。

1.1.2 培养基 斜面培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 斜面活化培养：将保存于砂土管的菌种转接于斜面培养基，30 ℃培养至全部形成孢子。

摇瓶发酵培养：挑取一环斜面菌苔接入发酵培养基，摇瓶发酵装液量为50 mL/500 mL，32 ℃、220 r/min振荡培养至芽孢20%左右脱落。

1.2.2 分析方法 活菌数及芽孢产量测定采用稀释平板计数法测定每单位体积或单位重量内含有的活菌数[5]。

1.3 试验设计

1.3.1 碳源单因子筛选 固定氮源为2%豆粕粉，选取蔗糖、饴糖、糖蜜、甘油、淀粉等几种常见的工农业副产物[6]作为碳源进行筛选。

1.3.2 氮源单因子筛选 选取碳源单因素筛选中确定的最佳碳源，选用鱼粉、蛋白胨、豆粕、花生粕等工农业副产品作为氮源进行筛选。

1.3.3 正交试验 通过单因素试验确定胶冻芽孢杆菌的最佳碳氮源和中心水平，选取碳氮源和无机盐进行4因子3水平正交试验，寻找最佳配方。

1.3.4 400 L罐发酵小试 利用单因素和正交试验得出的最佳配方，在400 L发酵罐中进行发酵试验，投料体积240 L，消泡剂0.1%，灭菌前调pH至7.5，灭菌、降温至35 ℃，接入200 mL孢子悬浮液，通气量12 m3/h，罐压0.5×105 Pa，32 ℃培养至芽孢脱落20%时放罐。发酵液实验室高速离心机离心5 000 r/min，10 min，弃去部分上清液，得到3倍浓缩液，浓缩液冷冻干燥得到冻干粉。

1.3.5 5 000 L罐发酵中试 采用优化后的配方，投料体积3 000 L，消泡剂0.1%，灭菌前调pH至7.5，灭菌、降温至35 ℃，接入1 000 mL孢子悬浮液，通气量150 m3/h， 罐压0.5×105 Pa，32 ℃培养至芽孢脱落20%时放罐。发酵液采用两种方式處理：一是取少量发酵液实验室离心，得到3倍浓缩液，冷冻干燥；二是车间碟片式离心机离心，浓缩液经离心式喷雾干燥塔喷雾干燥得到原粉。

2 结果与分析

2.1 碳源单因子试验结果

碳源的筛选试验如表1所示。不同碳源对活菌量及芽孢的形成有很大的影响，在分别以葡萄糖、甘露醇、乳糖、饴糖为碳源的情况下菌量小且均不能形成芽孢， 在淀粉中菌量最大但只有60%可形成芽孢，而在甘油、糖蜜等碳源中可形成芽孢，菌量可达4.7×108 CFU/mL。这可能是因为在乳糖、葡萄糖等还原性糖为碳源的培养基中，菌体生长过快从而积累生理酸性物质，pH长期低于6.0且很难回升，导致菌体无法形成芽孢直至衰老、自溶[6]。也有可能是因为速效碳源、菌体营养生长过盛。综合碳源的还原性和迟效性，选用甘油和玉米淀粉作为复合碳源[7]进行下一步的试验。

2.2 氮源单因子试验结果

氮源的筛选试验如表2所示。从表2可以看出，除玉米浆粉外，这几种有机氮源对胶冻样芽孢杆菌产孢率影响并不大。活菌数差别较大，以花生粕、蛋白胨、玉米酒糟为氮源时菌量均超过10×108 CFU/mL，尤以花生粕为氮源时菌量18.5×108 CFU/mL。综合芽孢产量、成本等因素，确定花生粕为最佳氮源。

2.3 正交试验结果

在单因子试验的基础上选取复合碳源、氮源和无机盐进行4因子3水平正交试验。正交试验的水平与因子的确定、正交试验结果、方差分析分别见表3、表4、表5。从表4和表5方差分析结果表明，这4种成分主效应排序为甘油>淀粉>碳酸钙>花生粕。两种碳源甘油、淀粉的F值分别为1.954、1.716，对芽孢产量的影响最大，而花生粕和碳酸钙对发酵的影响不是很大。确定最佳配方为甘油0.8%，淀粉0.6%，花生粕1.5%，碳酸钙0.1%。

2.4 400 L试验罐发酵

发酵周期39 h，发酵29 h取样镜检，个别形成孢囊，菌体大小整齐。放罐时取样镜检，芽孢50%左右脱落，大小一致，同步率98%。将发酵液和冷冻干燥粉分别进行稀释平板计数，发酵液芽孢产量18×108 CFU/mL，3倍浓缩液冻干粉芽孢产量2 748×108 CFU/g。

2.5 5 000 L发酵罐发酵

发酵周期43 h，发酵34 h取样镜检，大部分菌体膨大，菌体大小整齐。放罐时取样镜检，孢子少量脱落，大小一致，同步率98%。将发酵液、冷冻干燥粉、喷雾干燥粉分别进行稀释平板计数，结果见表6。5 000 L中试放大，相对于400 L罐，不论从孢子形成率、芽孢产量、发酵周期都相当，证明中试放大方案是可行的。5 000 L发酵液喷雾干燥粉水平与冷冻干燥粉相差较大，可能原因有二：一是离心浓缩工艺中参数设置不当，离心过程中孢子随着上清液流失较多；二是芽孢耐热性能与其他芽孢杆菌有差异，喷雾干燥过程中有损失。

3 小结与讨论

通过单因素碳氮源筛选和正交试验，获得胶冻样芽孢杆菌菌株最佳培养基配方为甘油 0.8%淀粉0.6%，花生粕1.5%，碳酸钙0.1%。采用该配方进行了400 L和5 000 L发酵罐小试和中试试验，发酵液和浓缩干燥粉芽孢产量均达到较高水平，尤其是冷冻干燥粉最高达2 910×108 CFU/g，喷雾干燥粉达933×108 CFU/g，具备了工业化生产的条件。

小试和中试发酵水平相对于摇瓶发酵存在差距，究其原因，可能与发酵过程中中间控制工艺包括培养温度、溶氧、pH控制等有关，下一步继续进行发酵工艺的优化。针对5 000 L发酵液喷雾干燥粉水平与冷冻干燥粉相差较大，将进行后处理工艺技术的优化，一是优化浓缩和干燥工艺，二是浓缩干燥过程中添加保护剂，尽量减少后处理过程中的损失，提高收率。

参考文献：

[1] 谢宗鹏.复合微生物菌肥的作用及其功效[J].农业科技与信息，2015（18）：75-76.

[2] 扎史品楚，农传江，王宇蕴，等.生物有机肥的發酵工艺及应用效果研究[J].环境工程，2015，33（增刊）：1011-1014，1020.

[3] 吴向华，刘五星.胶冻样芽孢杆菌培养条件及发酵工艺的优化[J].江苏农业科学，2006（4）：155-158.

[4] 张爱民，李乃康，赵钢勇，等.土壤中解磷、解钾微生物研究进展[J].河北大学学报（自然科学版），2015，35（4）：442-447.

[5] 周德庆.微生物学实验手册[M].上海：上海科学技术出版社，1986.

[6] 李 冰，赵 勋，王 岩，等.胶质芽孢杆菌工业化发酵研究进展[J].农业科学研究，2014，35（1）：68-72.

[7] 周荣华，崔怡宁，饶 犇，等.多粘芽孢杆菌发酵放大工艺研究[J].湖北农业科学，2015，54（11）：2034-2036.