异柠檬酸脱氢酶-1突变与胶质瘤化疗疗效关系的初步研究

韩松 陆宇 董韬 于春泳 李晓明 潘冬生 冯思哲

(沈阳军区总医院神经外科，辽宁 沈阳 110016)

异柠檬酸脱氢酶-1突变与胶质瘤化疗疗效关系的初步研究

韩松 陆宇 董韬 于春泳 李晓明 潘冬生 冯思哲*

(沈阳军区总医院神经外科，辽宁 沈阳 110016)

目的回顾性研究人脑胶质瘤患者46例中异柠檬酸脱氢酶-1(IDH1) R132H变异与其化疗疗效的关系。方法采用建立的MGB双荧光探针实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法检测患者IDH1基因R132H突变，同时根据临床随访获得患者化疗预后情况，比较IDH1基因132位点突变与野生型患者化疗预后及生存分析。结果单因素分析IDH1基因突变的继发性胶质母细胞瘤(sGBM)患者化疗后有更长的无进展生存期(PFS)和总体生存期(OS) (P<0.001)，患者年龄小于50岁，行为状态评分(KPS)大于80均有较长的PFS和OS；多因素分析(COX回归分析)中，IDH1基因突变与PFS和OS呈显著正相关(P<0.001)；TMZ化疗显示IDH1基因突变中有效组患者为47.2%，IDH1基因野生型中有效组患者为10.0%，两组间差异具有统计学意义(P<0.001)。生存分析显示替莫唑胺(TMZ)化疗患者IDH1基因突变有更长的PFS。结论本实验结果分析显示IDH1基因R132H突变是sGBM患者TMZ化疗疗效的敏感指标之一，为后续sGBM治疗提供新的参考选择。

胶质瘤; IDH1突变; 诊断; 治疗

人脑胶质瘤是常见的颅内肿瘤类型之一，其中最严重的是WHO Ⅳ级胶质瘤，即胶质母细胞瘤，患者通常伴有严重的认知功能障碍并在短时间内(≤1 年)死亡[1]。低级别胶质瘤预后程度不一，其结果受肿瘤组织病理学分型及治疗方式的多重影响。由于胶质瘤的组织特异性，临床上主要的治疗方法是采用手术切除联合放射及化学药物治疗。

异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1, IDH1)突变在 WHO Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤患者中均有发生。在WHO Ⅱ级胶质瘤中，IDH1突变率为50%～80%[2]；在 WHO Ⅱ～Ⅲ级胶质瘤(包括星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤)的共同检测中，IDH1突变率达70%以上[3]；在WHO Ⅳ级胶质瘤中，IDH1突变率在继发性肿瘤中为70%～80%，而在原发性肿瘤中仅不到10%[4]。很多回顾性研究证实了IDH1突变与胶质瘤患者预后的关系，前瞻性的研究中也有所报道。在德国的一项多中心(German Glioma Network, GGN)前瞻性的胶质瘤研究中[5]，分析了突变与患者预后的相关性，其中16位IDH1突变的多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiform, GBM)患者中位数总生存期为30个月，270位IDH1野生型GBM患者的中位数总生存期仅为11.2个月，并且IDH1突变患者无进展生存期(progression-free survival, PFS)也明显长于IDH1野生型者[相对危险率(relative risk, RR): 0.42; 95%可信区间(confidence interval, CI), 0.19～0.91;P=0.028]。IDH1突变作为胶质瘤新的强有力的预后指标是否与化疗药物的疗效有一定的相关性，目前国内的相关报道较少。本研究纳入继发性多形性胶质母细胞瘤(secondary glioblastoma multiform, sGBM)患者46例，分析IDH1基因R132H突变，以及给予口服替莫唑胺(temozolomide, TMZ)化疗6～18个疗程，分析IDH1突变与患者临床预后的关系。

材料与方法

一、一般资料

收集2009年1月至2015年12月经手术证实的继发性胶质瘤母细胞(sGBM)肿瘤石蜡包埋组织46例。患者的临床资料可通过沈阳军区总医院电子病历系统进行查询，患者的随访主要通过电话随访和门诊随访两种方式。患者的入选标准：①患者最后一次手术时年龄在18岁以上(包括18岁)；②既往有病理组织学上明确的低级别胶质瘤和间变性胶质瘤证据；③有详细的临床资料和随访数据；④有足够的肿瘤标本；⑤住院时间2009年1月到2015年12月，接受TMZ治疗；⑥至少接受过2个疗程的TMZ治疗后再进行TMZ疗效的评价(临床症状和体征以及影像学表现；在做基因学检测之前所有的肿瘤标本都经过两位神经病理学专家再次审阅，所有患者的影像学资料都经过两位神经影像学专家和一位神经外科专家在不知道标本基因检测结果的情况下审阅。

二、主要试剂及仪器

组织基因组DNA提取试剂盒购于Qiagen公司，T-easy克隆试剂盒购于Promega公司，质粒小提试剂盒购于上海生工公司，DNA纯化试剂盒购于Qiagen公司，PCR扩增试剂购于Takara公司，其它生化试剂均为国产分析纯，引物及MGB荧光探针由上海生工合成，台式高速冷冻离心机(Thermo)，实时荧光定量PCR仪(上海宏石，SLAN)。

三、研究方法

①IDH1基因R132H位点检测方法的建立 组织基因组DNA提取 取 10 μm 蜡块切片(1.5 cm×2 cm) 5张进行二甲苯处理，加1 mL二甲苯，65 ℃恒温震荡10 min，10 700 r/min， 离心5 min，去上清，重复二甲苯处理 3 次。加无水乙醇1 mL，混匀，10 700 r/min，离心 5 min，去上清，以95%、75% 乙醇各离心沉淀1次。空气干燥后，严格按照Qiagen组织基因组DNA提取试剂和说明书操作，提取的基因组DNA置于-20 ℃备用。②双色荧光PCR法检测IDH1基因R132H突变方法的建立 IDH1基因132位点突变R为野生型探针用FAM标记，H为突变型探针用HEX标记。上游引物序列：5'-CG GCTTGTGAGTGGATGGGT-3'； 下游引物序列：5'-GCTTA ATGGGTGTAGATACC-3'；R探针序列：5'-FAM-CATAG GTCGTC ATGCTTAT-MGB-3'；H探针序列：5'-HEX-CAT AGGTCATCATGCTTAT-MGB-3'。PCR反应体系为30 μL，其中DNA模板1 μL；上下游引物浓度为0.2 μmol/L，探针浓度为0.3 μmol/L(R与H各0.15 μmol/L)，Mg2+浓度为3.5 mmol/L，1.25 U Taq DNA；PCR反应条件为94 ℃预变性3 min；之后94 ℃变性15 s，62 ℃退火40 s(双通道采集荧光)；40个循环。③结果判定：根据典型的特异性扩增曲线判读相应型别，FAM 扩增为R野生型，HEX扩增为H突变型。

四、替莫唑胺(temozolomide, TMZ)化疗疗效评价

46例患者都有病理证实的低级别胶质瘤或者间变性胶质瘤病史，并且既往行手术切除和术后规范的放射治疗但没有化疗。复发后经病理确认由原有的低级别胶质瘤进展为sGBM。故予以TMZ化疗。通过观察TMZ化疗对残余肿瘤的影响，来判断IDH1基因R132H突变与TMZ疗效的关系。TMZ的化疗方案：口服TMZ 200 mg/m2/d，连续用药5 d，28 d为一个疗程。每两个疗程后随访一次。包括临床症状和体征的检查以及磁共振平扫加增强检查，(按照MacDonald标准执行[6])具体判定标准是：部分有效(partial response, PR)：肿瘤体积缩小50%以上；轻微起效(minor response, MR)：肿瘤体积缩小25%～50%之间；肿瘤进展(disease progression, DP)：肿瘤体积增加超过25%或者患者肿瘤相关的神经功能障碍逐渐加重；病情稳定(stable disease, SD)：上述几种情况都不符合并且持续4个TMZ疗程以上；判断肿瘤进展时要注意区分其与肿瘤的假性进展(pseudoprogression)和假性应答(pseudoresponse)[7]。

五、统计学分析

所有统计学计算均使用SPSS 16.0软件完成。计数资料采用卡方检验进行差异性分析，独立样本t检验用来分析IDH1突变阳性组和IDH1突变阴性组的年龄差别。无进展生存期(progression-free survival, PFS)和总体生存期(overall survival, OS)用来反映患者的预后情况。应用Kaplan-Meier法检验生存分析、Log-rank法显著性检验以比较不同患者的生存差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者基本临床资料

共有46例继发性GBM患者纳入研究，患者基本资料详见表1。

表1 46例继发性GBM患者临床资料

Tab 1 Clinical data of 46 patients with secondary GBM

二、单因素分析IDH1基因突变与患者TMZ化疗疗效关系

按照建立的方法检测，IDH1突变发生率为78.26%(36/46)，统计分析结果表明IDH1基因突变的sGBM患者化疗后有更长的PFS和OS(P<0.001)，患者年龄和KPS评分都与PFS和OS相关。年龄小于50岁，KPS评分大于80均有较长的PFS和OS。见表2。

表2 单因素分析临床资料及IDH1基因突变与患者PFS和OS关系(卡方检验)

Tab 2 Relationship between PFS and OS of clinical data and IDH1 gene mutations in patients by univariate analysis (chi square test)

VariablesnPFS(month)PvalueOS(month)Pvalue Sex Male2510.40.90310.80.746 Female2110.111.6 Age(year) ≤503312.6<0.00112.4<0.001 >50137.39.3 KPSgrade ≤80199.50.02110.40.019 >802711.413.6 IDH1mutation R(Wildtype)106.6<0.0018.6<0.001 H(Mutation)3612.412.6

三、多因素分析IDH1基因突变与患者TMZ化疗疗效关系

多因素分析(COX回归分析)表明，IDH1基因突变与PFS和OS呈显著正相关(P<0.001)。详见表3。

表3 多因素分析临床资料及IDH1基因突变与患者PFS和OS关系(Cox回归分析)

Tab 3 The relationship beween PFS and OS of clinical data and IDH1 gene mutations in patients by multivariate analysis (Cox regression)

VariablePFSPvalueHROSPvalueHR Age≤50years0.7331.1460.7151.150 KPSgrade>800.1950.7880.1920.790 IDH1H(Muta-tion)<0.0010.104<0.0010.104

四、Kaplan-Meier法生存分析IDH1基因突变与患者PFS之间关系

患者接受TMA治疗的疗程中位数是6个疗程(2～18个疗程)。46例患者接受TMZ治疗后，8例部分有效(17.4%)，9例轻微起效(19.6%)，7例病情稳定(15.2%)，21例患者出现病情恶化(45.7%)，有效组(包括轻微有效，部分有效和病情稳定)，IDH1基因突变中有效组患者为17例(17/36, 47.2%)，IDH1基因野生型中有效组患者为1例(1/10, 10.0%)两组间差异具有统计学意义(P<0.01)。生存分析显示IDH1基因突变患者有更长的PFS(图1)。

图1 生存分析IDH1 突变与患者PFS 之间关系

Fig 1 The relationship between IDH1 mutation and PFS by survival analysis

讨 论

GBM是成年人中最常见、恶性程度最高的脑肿瘤[8]，也是恶性胶质瘤中最常见的类型[9]，其年发病率约为3/10万～5/10万[10-11]，可发生在任何年龄段，最常发生在老年人(年龄的中位数为64岁；sGBM患者发病年龄要稍年轻，年龄的中位数为45岁)，很少发生在儿童患者[11-13]。GBM具有很高的致残和致死率，严重威胁人类健康，而其治疗前景至今仍然不容乐观。即使经过最大程度上的手术切除和术后规范的CCRT，GBM患者的中位PFS和OS也仅仅只有7个月和15个月[14-15]。90%以上的GBM是原发性的，病程进展很快，从几天到几周不等。约10%的GBM是继发性的，是由WHO Ⅱ或Ⅲ级胶质瘤逐渐进展而来[10,13,16]。两者具有截然不同的分子生物学转导通路。

欧洲癌症治疗研究组织(European Organization for Research on Treatment of Cancer, EORTC)与加拿大国家癌症研究院(National Cancer Institute of Canada, NCIC)合作，进行了一项具有里程碑式意义的大样本、多中心III期临床实验(EORTC trial 26981/22981 and NCIC trial CE.3)研究，研究发现，在85个中心的573例GBM患者的综合治疗中，单纯放疗组和放疗辅以TMZ化疗组的中位生存期分别为12.1个月和14.6个月，2年生存率分别为10.4%和26.5%，表明在单纯放疗的基础上辅以TMZ可以使生存期延长[14]。前期的研究表明[5]，MGMT启动子甲基化是GBM患者对TMZ化疗的疗效的一个敏感指标，但最近的研究显示MGMT启动子甲基化的WHO Ⅲ级的间变性胶质瘤患者，不管术后是单纯放疗还是单纯的TMZ或者PCV化疗，都具有更长的PFS和OS[17]。因此，到目前为止MGMT启动子甲基化影响患者临床结局的机制仍然不清楚。

IDH1基因突变导致编码区变异132位点突变(由R突变为H)，占总R132位点突变的98%以上，本研究只检测了R132H突变形式[18]。本研究证实IDH1基因突变广泛存在于sGBM中，突变发生率为78.26%(36/46)，单因素及多因素分析显示IDH1基因R132H突变是sGBM患者TMZ化疗疗效的敏感指标之一。但目前IDH1基因突变影响患者临床预后仍没有合理的解释。推测可能是IDH1丧失原有蛋白活性减缓了肿瘤生长，并且抑制细胞的抗氧化应激能力，从而促进化疗药物诱导细胞凋亡。

基于分子遗传学指标的人脑胶质瘤分型终究会取代传统病理组织学分型，因为前者更具个体化，更能体现各型胶质瘤的不同发病机制，为临床治疗提供潜在的治疗靶点，这无疑是传统病理组织学分型难以实现的。在今后的sGBM和GBM临床诊治和临床试验中，要综合考虑MGMT启动子甲基化和IDH1基因突变对患者临床预后的影响。

1VERHAAK R G, HOADLEY K A, PURDOM E, et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1 [J]. Cancer Cell, 2010, 17(1): 98-110.

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Therelationshipbetweenisocitratedehydrogenasegenemutationandchemotherapyingliomas:apreliminarystudy

HANSong,LUYu,DONGTao,YUChunyong,LIXiaoming,PANDongsheng,FENGSizhe

DepartmentofNeurosurgery,TheGeneralHospitalofShenyangMilitaryCommand,Shenyang110016, China

ObjectiveThe relationship between IDH1 R132H variation in 46 patients with glioma and the chemotherapy efficacy was invesigated.MethodsThe real-time fluorescence quantitative PCR (MGB) method was used to detect the R132H mutation of IDH1 gene. At the same time, the prognosis of patients with chemotherapy was obtained by clinical follow-up. The prognosis of chemotherapy and survival analysis was compared between the patients with IDH1 R132H variation and the wild-type patients.ResultsUnivariate analysis showed that the patients with secondary glioblastoma (sGBM) with IDH1 mutations had longer PFS and OS after chemotherapy (P<0.001); the patients younger than 50 years and with KPS scores >80 had longer PFS and OS (P<0.001). Multivariate analysis (COX regression analysis) showed that IDH1 gene mutation was positively correlated with PFS and OS (P<0.001). Effective group of patients with IDH1 gene mutation and wild-type was 47.2% and 10.0%, respectively. The difference between two groups was statistically significant (P<0.001). Survival analysis showed that TMZ patients with IDH1 gene mutations had longer PFS.ConclusionThe results of this study show that IDH1 gene R132H mutation is a sensitive indicator of TMZ chemotherapy in patients with sGBM, which provides a new reference for subsequent treatment of sGBM.

Glioma; IDH1 mutation; Diagnosis; Treatment

Cell transplantation therapy for spinal cord injury

AssinckP1,2,DuncanGJ1,3,HiltonBJ1,3,PlemelJR4,TetzlaffW1,3,5

1International Collaboration on Repair Discoveries, University of British Columbia, Vancouver, Canada;2Graduate Program in Neuroscience, University of British Columbia, Vancouver, Canada;3Department of Zoology, University of British Columbia, Vancouver, Canada;4Department of Clinical Neurosciences and the Hotchkiss Brain Institute, University of Calgary, Calgary, Canada; 5Department of Surgery, University of British Columbia, Vancouver, Canada

R 739

A

1671-2897(2017)16-212-05

韩松，主治医师，E-mail: drhansong@126.com

*通讯作者： 冯思哲，主任医师，E-mail: fengsizhe@sohu.com

2016-12-05；

2017-03-22)

AbstractSpinal cord injury can lead to severe motor, sensory and autonomic dysfunction. Currently, there is no effective treatment for the injured spinalcord. The transplantation of Schwann cells, neural stem cells or progenitor cells, olfactory ensheathing cells, oligodendrocyte precursor cells and mesenchymal stem cells has been investigated as potential therapies for spinal cord injury. However, little is known about the mechanisms through which these individual cell types promote repair and functional improvements. The five most commonly proposed mechanisms include neuroprotection, immunomodulation, axon regeneration, neuronal relay formation and myelin regeneration. A better understanding of the mechanisms whereby these cells promote functional improvements, as well as an appreciation of the obstacles in implementing these therapies and effectively modeling spinal cord injury, will be important to make cell transplantation a viable clinical option and may lead to the development of more targeted therapies.

10.1038/nn.4541