CCR7在人肝癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

廖宇圣， 张 姮， 李 晖， 黄曼玲， 胡 美， 周婷婷， 吴 杰

华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院消化内科，武汉 430070

CCR7在人肝癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

廖宇圣， 张 姮， 李 晖， 黄曼玲， 胡 美， 周婷婷， 吴 杰△

华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院消化内科，武汉 430070

目的观察趋化因子受体CCR7在肝癌中的表达情况，并探讨CCR7表达水平与临床病理特征的关系。方法采用荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)、免疫印迹(Western blot)及免疫组织化学技术检测CCR7蛋白在肝癌组织和配对癌旁组织、人肝癌细胞HepG2和人正常胎肝细胞L02中的mRNA及蛋白表达量，比较其差异，并分析CCR7蛋白表达水平与肝癌临床病理特征之间的相关性。结果免疫组化检测结果显示CCR7在肝癌组织和癌旁组织中的蛋白表达均定位于细胞质，且CCR7蛋白在癌旁组织与肝癌组织中的阳性表达率分别为24.2%(15/62)和66.1%(41/62)，两者差异有统计学意义(χ2=22.013，P<0.05)。Real-time PCR检测结果显示，CCR7在癌旁组织中的mRNA表达显著低于肝癌组织[(0.512±0.109)vs.(1.591±0.221)，t=-34.403，P<0.01]，在L02细胞中的表达亦低于HepG2细胞[(0.485±0.106)vs.(1.768±0.281)，t=-33.629，P<0.01]。Western blot检测结果显示CCR7在癌旁组织中的蛋白表达同样低于肝癌组织(P<0.05)、在L02细胞中的表达同样低于HepG2细胞(P<0.05)。且CCR7蛋白表达量与肿瘤大小、门静脉癌栓、肝外转移、Child分级、BCLC分期显著相关(均P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤数目、乙肝、肝硬化、血清AFP无明显相关(均P>0.05)。结论CCR7在人肝癌组织中表达显著增高，其表达水平与肝癌的发生发展、侵袭转移密切相关。

趋化因子受体； 肝癌； 侵袭转移

原发性肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)为我国常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率居于我国恶性肿瘤的第2位[1]。HCC的5年生存率仅为10%，预后差，复发和转移是导致患者长期生存率较低的主要原因，机制不明[2-3]。因此，阐明肝癌侵袭转移的机制、寻找特异性肿瘤分子标志物是进一步提高肝癌疗效的关键。趋化因子(chemokines)是一类分泌型小分子蛋白质，近年来发现其与肿瘤侵袭转移密切相关[4-5]。研究表明：趋化因子受体CCR7是7次跨膜受体G蛋白偶联受体，在肿瘤细胞的增殖、迁移、播散及肿瘤血管形成中发挥关键作用[6-7]。本研究旨在采用Real-time PCR、Western blot及免疫组化等技术检测CCR7在人肝癌组织及配对癌旁组织中的表达，探讨其表达水平与临床病理特征的相关性。以期为寻找肝癌新的治疗靶点提供有力依据。

1 资料与方法

1.1 病例来源

选取武汉市中心医院消化内科2015年1月至2016年12月的62例人肝癌组织及配对癌旁组织标本，所有标本均经本院病理科诊断证实为原发性肝细胞癌。62例肝癌组织标本及配对的癌旁组织标本(距肿瘤边缘>2 cm处为准)离体后立即置入液氮中保存。所有标本的获取均得到患者本人及家属同意，并通过我院伦理委员会批准。

1.2 主要材料

兔抗人FAM96B单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体及二抗均购自Abcam公司，免疫组化试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色液购自武汉博士德生物公司，Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒均购于大连TaKaRa生物技术有限公司，总蛋白抽提试剂盒、ECL化学发光试剂盒及蛋白浓度检测试剂盒均购自Invitrogen公司。DMEM高糖培养液、胎牛血清(FBS)、0.05%胰蛋白酶均购自Sigma公司。人肝癌细胞系HepG2、人正常胎肝L02细胞均保存于本院中心实验室。CCR7引物序列：上游5′-AGGCTATTGTCCCCTAAACC-3′，下游5′-GGAGGACAGTGAAGAAAACG-3′；β-actin引物序列：上游5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，下游5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，均由上海英骏生物工程技术服务公司设计并合成。

1.3 Real-time PCR检测CCR7 mRNA表达

按照Trizol试剂盒操作说明书提取62例肝癌组织及配对癌旁组织的总mRNA。利用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，低温保存备用。Real-time PCR总反应体系设为20 μL，其中2×SYBR Green mix缓冲液10 μL，上下游引物各0.6 μL(浓度为10 μmol/L)，cDNA 2 μL，DEPC水补齐至20 μL。反应条件为：94℃变性20 s，58℃退火15 s，72℃延伸30 s；共35个循环。各组中CCR7的表达采用2-ΔΔCt法计算，以目的基因与内参的比值反映相对表达量。

1.4 Western blot检测CCR7蛋白表达

分别称取0.08 g肝癌组织和癌旁组织，加800 μL全蛋白提取液提取蛋白，Bradford法蛋白定量。各组取120 μg上样于5.0%浓缩胶，15%分离胶，行SDS-PAGE电泳分离。转移蛋白于PVDF膜，5%脱脂奶粉稀释的CCR7及β-actin一抗孵育，4℃过夜，HRP标记二抗，37℃温育，化学发光法显影检测。免疫印迹条带的灰度值经灰度扫描仪分析后获得。CCR7蛋白在肝癌组织中的表达量以肝癌组织CCR7条带的灰度值与对应的β-actin的灰度值之比表示。

1.5 免疫组织化学染色及结果判定

免疫组织化学染色按试剂盒实验步骤操作，常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，微波抗原修复，兔抗人CCR7单克隆抗体(1∶200稀释)，4℃过夜孵育，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片固定。用磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作阴性对照，相同条件下每个样本重复3次。结果判定标准：CCR7表达免疫组化结果根据阳性细胞率进行评定和分析。未见阳性细胞或阳性细胞率<5%判定为阴性(-)，将阳性细胞率5%～、25%～、50%～分别定为弱阳性(+)、中度阳性()、强阳性()。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 免疫组织化学染色结果

CCR7蛋白主要表达于细胞质，见图1。在癌旁组织中，细胞质着色多为淡黄色，CCR7为阴性、弱阳性或中度阳性，然而，在肝癌组织中染色较深，以棕黄色和棕黑色为主，CCR7为弱阳性、中度阳性或强阳性。将中度阳性及强阳性均判定为阳性表达，CCR7蛋白在癌旁组织与肝癌组织中的阳性表达率分别为24.2%(15/62)和66.1%(41/62)，两者差异有统计学意义(χ2=22.013，P<0.05)。

2.2 CCR7在肝癌组织中的表达

Real-time PCR检测结果显示，CCR7在癌旁组织中的mRNA表达低于肝癌组织[(0.512±0.109)vs.(1.591±0.221)，t=-34.403，P<0.01]。Western blot检测结果显示CCR7在癌旁组织中的蛋白表达同样低于肝癌组织[(0.689±0.138)vs.(1.635±0.270)，t=-24.297，P<0.01]，见图2。

A：癌旁组织；B：肝癌组织图1 免疫组织化学法检测CCR7蛋白的表达(×200)Fig.1 The mRNA and protein expression of CCR7 detected by immunohistochemistry(×200)

与癌旁组织比较，*P<0.05图2 肝癌组织及癌旁组织中CCR7的mRNA(A)和蛋白(B)表达Fig.2 The mRNA (A)and protein(B) expression of CCR7 in liver cancer tissues and their adjacent non-tumor tissues

2.3 CCR7在HepG2细胞和L02细胞中的表达

CCR7 mRNA在L02细胞中的表达低于HepG2细胞[(0.485±0.106)vs.(1.768±0.281)，t=-33.629，P<0.01]，应用Western blot在L02细胞和HepG2细胞均可检测到CCR7蛋白表达，但在L02中表达显著低于HepG2[(0.546±0.117)vs.(1.554±0.161)，t=-39.994，P<0.01]。见图3。

与L02细胞比较，*P<0.05图3 HepG2细胞和L02细胞中CCR7的mRNA(A)和蛋白(B)表达Fig.3 The mRNA(A)and protein(B)expression of CCR7 in HepG2 cells and L02 cells

2.4 CCR7蛋白表达水平与肝癌临床病理特征之间的关系

CCR7蛋白表达量与肿瘤大小、门静脉癌栓、肝外转移、Child分级、BCLC分期显著相关(均P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤数目、乙肝、肝硬化、血清AFP无明显相关(均P>0.05)。见表1。

表1 CCR7蛋白表达量与肝癌临床病理特征之间的关系Table 1 The correlation between expression of CCR7 and clinicopathological characteristics of liver cancer(±s)

3 讨论

趋化因子是指能使细胞发生趋化运动的分泌型小分子蛋白质(相对分子质量为8～11 kD)，趋化因子受体是能够特异性结合趋化因子的7次跨膜G蛋白偶联受体[8-9]。CCR7为CC类趋化因子受体之一，越来越多的证据显示，CCR7在黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌和胃癌等肿瘤细胞中过度表达，与肿瘤的淋巴结转移和侵袭转移密切相关[10-11]。然而，对于CCR7在肝癌生长、浸润、侵袭和转移中的作用研究甚少。

在肿瘤组织及其相应邻近正常组织的差异性表达是分析基因与肿瘤关系的基础，异常表达的基因可能在肿瘤的形成中扮演重要角色，被认为是潜在的新一类控制细胞增殖和凋亡的癌基因和抑癌基因[12]。本研究中Real-time PCR和Western blot检测结果均显示CCR7在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且在人肝癌细胞系HepG2中的表达显著高于人正常胎肝细胞系L02。以上结果表明：CCR7在肝癌组织和细胞中高表达。有研究表明：肝癌的发生发展是包括原癌基因激活和(或)抑癌基因失活在内的多阶段、多步骤过程[13]。本研究结果提示：CCR7在肝癌发生发展过程中扮演重要角色，可能是癌基因，也可能通过间接作用促进肝癌和其他肿瘤的发生发展。

本研究结果显示：CCR7蛋白在癌旁组织与肝癌组织中的阳性表达率分别为24.2%和66.1%。其表达差异具有统计学意义。有研究表明，约80%的结肠癌组织表达CCR7，且多因素回归分析得出CCR7高表达是与淋巴结转移相关的最重要因素[14]。本研究结果与这一结论基本相符。提示CCR7在肝癌组织中表达率升高参与了肝癌发生发展。

为进一步探讨CCR7在肝癌发病机制中的作用，本研究通过统计分析CCR7蛋白表达与肝癌临床病理特征之间关系得出：CCR7在肝癌组织中高表达与肝癌患者的性别、年龄、肿瘤数目、乙肝、肝硬化、血清AFP无明显相关。目前，血清AFP是临床上被用来筛查和早期诊断及评价肝癌预后的实用且可行的方法。但只有40%～60%的肝癌患者AFP增高，还有部分患者AFP的值没有增高，而且并非所有肝癌细胞都分泌AFP。因此AFP用来诊断肝癌容易造成漏诊[15]。而本研究提示：CCR7有望成为不依赖AFP的肝癌标记物。肝癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，究其原因侵袭转移是导致肝癌患者死亡的关键因素，即使接受根治性手术治疗的肝癌患者，由于高复发和转移率，术后5年生存率亦较低[2]。本研究结果显示：CCR7在肝癌组织中高表达与肿瘤大小、门静脉癌栓、肝外转移、Child分级、BCLC分期显著相关。Mashino等[16]报道CCR7在胃癌组织中高表达与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关。本研究结果与其基本一致。

综上所述，肝癌组织和肝癌细胞中CCR7的表达水平均升高，且CCR7在肝癌发生发展、侵袭转移过程中发挥关键作用，提示CCR7可能成为一个新的肝癌生物学标志物，对肝癌的防治具有重要借鉴价值。相信随着科研工作者对CCR7研究的不断深入，将有助于进一步阐明肝癌的发病机制，进而为肝癌的临床治疗及预后提供新的靶点。

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ExpressionofChemokineReceptorCCR7inHumanLiverCancerTissuesandItsCorrelationwithClinicopathologicalCharacteristics

Liao Yusheng，Zhang Hen，Li Huietal

DepartmentofGastroenterology，TheCentralHospitalofWuhan，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430070，China

ObjectiveTo investigate the expression difference of chemokine receptor CCR7 in 62 cases of liver cancer and explore the correlation between CCR7 expression and clinical biological characteristics of liver cancer.MethodsReal-time PCR，Western blotting and immunohistochemistry were used to examine the expression and distribution of CCR7 in liver cancer tissues and their adjacent tissues，HepG2 cells and L02 cells.Furthermore，the correlation between the expression difference of CCR7 and clinicopathological characteristics of liver cancer was analyzed.ResultsImmunohistochemistry showed that CCR7 protein was located in cytoplasm.In addition，the positive expression rate of CCR7 in tumor-adjacent tissues and liver tissues was 24.2%(15/62)and 66.1%(41/62)，the difference was statistically significant(χ2=22.013，P<0.05).CCR7 mRNA levels were significantly lower in tumor-adjacent tissues than in liver tissues[(0.512±0.109)vs.(1.591±0.221)，t=-34.403，P<0.01] and lower in L02 cells than in HepG2 cells[(0.485±0.106)vs.(1.768±0.281)，t=-33.629，P<0.01].While CCR7 protein expression levels were lower in adjacent tissues than in liver tissues and lower in L02 cells than in HepG2 cells(allP<0.05).Moreover，the expression difference was correlated with tumor size，portal vein tumor thrombosis，Child-Turcotte-Pugh，extrahepatic metastasis，Barcelona Clinic Liver Cancer(BCLC)classification(P<0.05)，but not with gender，age，tumor number，hepatitis B virus，cirrhosis of the liver and serum AFP of patients(P>0.05).ConclusionThe CCR7 protein expression is significantly increased in liver cancer tissues as compared with its adjacent normal tissues.Additionally，CCR7 may be a good marker to evaluate the development，invasion and metastasis of liver cancer.

chemokine receptor； liver cancer； invasion and metastasis

廖宇圣，男，1977年生，医学硕士，副主任医师，E-mail：63669165@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：wujie988@sina.com

R735.7

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.011

(2017-04-10 收稿)