HAUSP表达水平对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响*

程传东， 牛朝诗， 董永飞， 牛万祥， 杨 洋

安徽省立医院神经外科，脑功能与脑疾病安徽省重点实验室，安徽省脑立体定向神经外科研究所，合肥 230001

HAUSP表达水平对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响*

程传东， 牛朝诗△， 董永飞， 牛万祥， 杨 洋

安徽省立医院神经外科，脑功能与脑疾病安徽省重点实验室，安徽省脑立体定向神经外科研究所，合肥 230001

目的探讨调控疱疹病毒相关泛素特异性蛋白酶(HAUSP)对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法构建HAUSP过表达及低表达质粒，转染胶质瘤U87、U251细胞，上调或下调胶质瘤细胞中HAUSP表达水平。荧光定量PCR、Western blot检测胶质瘤细胞中HAUSP mRNA和蛋白表达水平；利用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖水平；流式细胞术检测细胞凋亡变化。同时检测各组细胞NANOG mRNA和蛋白表达情况。结果成功构建稳定HAUSP过表达和低表达U87、U251细胞株；与空白对照组相比，HAUSP过表达组细胞中，HAUSP的mRNA、蛋白水平均明显增加，NANOG mRNA水平无明显变化，但NANOG蛋白水平增加，同时细胞增殖能力增强，细胞凋亡水平降低；与空白对照组相比，HAUSP干扰组细胞中，HAUSP的mRNA、蛋白水平表达均降低，NANOG mRNA水平无明显变化，但NANOG蛋白水平降低，同时细胞增殖能力减弱，细胞凋亡水平增加。结论HAUSP过表达可促进胶质瘤细胞的增殖，这一过程中伴随着NANOG蛋白水平的增高。因此，HAUSP可能通过维持NANOG去泛素化状态而维持胶质瘤细胞的增殖活性。

神经胶质瘤； HAUSP； NANOG； 去泛素化； 肿瘤干细胞

疱疹病毒相关泛素特异性蛋白酶(HAUSP)基因定位于人染色体16p13.3，HAUSP蛋白是泛素特异性修饰酶家族成员之一，可维持底物蛋白去泛素化状态，是泛素-蛋白酶体系统的重要调节器，与肿瘤发生发展关系密切[1-2]。HAUSP通过去泛素化作用参与蛋白水平调控，在肿瘤的发生发展中扮演抑癌蛋白或癌蛋白角色，可因不同的细胞亚群或组织类型而呈现出不同的生物学特性。我们前期研究发现，HAUSP在脑胶质瘤组织中表达增多，与胶质瘤细胞的增殖及低分化状态有密切相关性，且与NANOG有共同亚细胞定位[3-5]。为进一步阐明HAUSP-NANOG调控网络与胶质瘤细胞生物学活性的关系，我们以胶质瘤细胞为基础，通过改变HAUSP表达水平，探讨HAUSP-NANOG调控网络对胶质瘤细胞生物学活性的影响。

1 材料与方法

1.1 U87与U251细胞的培养

U87及U251胶质瘤细胞株购自中科院上海细胞库，培养于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12(1∶11)培养液中，常规换液，细胞生长至70%～80%汇合时进行传代培养。

1.2 材料与试剂

兔抗人HAUSP多克隆抗体(Santa Cruz公司)，小鼠抗人NANOG单克隆抗体(Abcam公司)，小鼠抗人GAPDH单克隆抗体(碧云天生物技术研究所)，RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)，Trizol(Invitrogen公司)，蛋白Marker、实时荧光定量PCR试剂盒miScript SYBR Green PCR Kit(QIAGEN公司)，超敏化学发光试剂盒、细胞增殖检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，引物均由上海生工公司合成；其它常规试剂为进口分装或国产分析纯。

1.3 过表达或低表达HAUSP质粒的构建及转染

收集各组对数生长期细胞，培养液调整细胞悬液密度至1×105/mL。于96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液，5%CO2，37℃孵育18 h，弃培养上清，无血清培养液Opti-MEM洗1次，加入转染试剂、过表达质粒和干扰质粒进行转染实验。成功建立稳定过表达和低表达HAUSP的U87、U251细胞株，荧光显微镜下观察可见所有细胞均稳定表达GFP荧光。根据HAUSP基因的序列(NM_001286457)，设计了2条干扰序列，GCCCGGTAATATGTCTCATCC(3397)和GCACCATACCC-AAATTATTCC(1152)，包装慢病毒后转染细胞，构建稳转细胞系。通过抗性筛选(puromycin)，获得稳定表达所携带基因的U251-1152、U251-3397、U251-HAUSP-O和U251-NC，以及U87-1152、U87-3397、U87-HAUSP-O和U87-NC细胞(图1)。

图1 构建稳定的HAUSP过表达和低表达细胞系(×40)Fig.1 Construction of stable HAUSP overexpression and low expression cell lines (×40)

1.4 定量PCR实验

收集各组细胞，Trizol法提取各组细胞总RNA，紫外分光仪检测RNA的纯度及含量，调整RNA浓度为1 μg/μL。用Prime Script©反转录酶逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应。HAUSP引物：上游5′-ATGAACCACCAGCAGCAGCAGC-3′，下游5′-GCGTGGCATCACCATAATCTTCC-3′，产物长度312 bp；NANOG引物：上游5′-GAGACTGTCTCTCCTCTTCCT-3′，下游5′-CCAGAAGACAAAGAACTGGCC-3′，产物长度150 bp；β-actin引物：上游5′-ATGGATGATGA-TATCGCCGCGCTC-3′，下游5′-TTTCTCCATG-TCGTCCCAGTTGG-3′，产物长度252 bp。按试剂盒要求，配置反应体系，PCR扩增，扩增方法及计算方法按照前期实验进行[3]。

1.5 Western blot检测

收集各组细胞，提取总蛋白，紫外分光法蛋白定量。常规电泳、转膜和封闭后，加入一抗兔抗人HAUSP多克隆抗体(1∶1 000)、小鼠抗人NANOG单克隆抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜，次晨加二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，ECL染色5 min，胶片曝光显影，结果用Quanlity One分析，GAPDH为内对照，以目的条带与内参的灰度值比表示其相对表达量。

1.6 细胞增殖试验

细胞转染病毒24～96 h后，将空白对照组、HAUSP过表达组、HAUSP干扰组胶质瘤细胞制备成单细胞悬液(2×104/mL)，将100 μL细胞悬液加入96孔板一孔中，每组设3个复孔，随后分别在24、48、72、96 h 4个时间点加入CCK-8(10 μL)，在37℃，5%CO2培养箱中孵育，分别用酶标仪在24、48、72、96 h 4个时间点检测胶质瘤细胞的吸光度(A)值。

1.7 细胞周期检测

胶质瘤细胞转染病毒48～72 h后，移液枪吸去培养液，PBS洗2次，每次5 min，再用0.25%胰酶消化细胞，使细胞从培养皿上脱落，显微镜下观察到大部分细胞脱落后，加入全细胞培养液4 mL并轻轻吹打细胞，再次将细胞悬液收集到离心管中，然后1 000 r /min离心5 min，吸去上清液，加入2 mL温浴PBS，重悬细胞，然后将细胞悬液转移到离心管中，再次离心，加入冰浴预冷70%乙醇2 mL，轻轻吹打混匀制成细胞悬液，在4℃条件下固定12～24 h。细胞固定后每管样品中加入25 μL碘化丙啶染色液(20×)，0.5 mL染色缓冲液和10 μL RNase A(50×)，轻轻地吹打细胞，37℃避光温浴30 min，随后放置4℃或冰浴避光保存。然后用流式细胞仪在450 nm波长处检测荧光，同时检测光反射情况。

1.8 细胞凋亡实验

将转染病毒48 h后的胶质瘤细胞用胰酶消化，PBS清洗2遍，将细胞密度调节为(1～5)×105/mL，用1×binding buffer 100 μL悬浮细胞后，分别加入5 μL 7-AAD和5 μL PE染料混匀。室温避光反应10～15 min后加入1×binding buffer 400 μL来悬浮细胞，再用流式细胞仪检测。

1.9 统计学处理

用SPSS 17.0统计软件包处理数据，计量资料以均数±标准差表示，计数资料以百分数表示，组间均数比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中HAUSP及NANOG mRNA的表达

与空白对照组相比，HAUSP过表达组中HAUSP mRNA水平明显上调(P<0.01)，HAUSP干扰组中HAUSP的mRNA水平明显下降(P<0.01)(图2)；与空白对照组相比，HAUSP过表达组中NANOG mRNA表达无明显差异(P>0.05)，HAUSP干扰组中NANOG mRNA表达亦无明显差异(P>0.05)(图3)。

与空白对照组(NC)比较，*P<0.05 **P<0.01图2 各组细胞中HAUSP mRNA表达水平Fig.2 HAUSP mRNA expression levels in each group

图3 各组细胞中NANOG mRNA表达水平Fig.3 NANOG mRNA expression levels in each group

2.2 各组细胞中HAUSP、NANOG蛋白表达水平

与空白对照组相比，HAUSP过表达组中HAUSP、NANOG的蛋白表达水平明显上调(P<0.05)，两者的上升趋势呈现一致；与空白对照组相比，HAUSP干扰组中HAUSP、NANOG的蛋白表达水平明显降低(P<0.01)，两者的下降趋势呈现一致(图4)。

2.3 各组细胞增殖能力

分别在转染24、48、72、96 h比较各组细胞的增殖能力。在24 h和48 h时间点，3组细胞增殖能力无明显差异(P>0.05)；在72 h和96 h时间点，HAUSP过表达组的细胞增殖能力较空白对照组明显增强，差异有统计学意义(P<0.01)；HAUSP干扰组的细胞增殖能力于96 h时间点较空白对照组明显减弱，差异有统计学意义(P<0.05)(图5)。

2.4 各组细胞的细胞周期

相对于空白对照组，HAUSP过表达组细胞表现出明显的周期停滞(S期细胞比例增加)，而干扰HAUSP表达会推进细胞周期的进程(G2/G1期细胞比例显著增加)(图6)。

2.5 各组胶质瘤细胞的凋亡率

通过流式细胞仪检测空白对照组、HAUSP过表达组和干扰组的胶质瘤细胞凋亡率。检测结果显示HAUSP过表达组的胶质瘤细胞比对照组细胞有更低的凋亡率，而下调HAUSP的表达可促进胶质瘤细胞凋亡(图7)。

与空白对照组(NC)比较，*P<0.05 **P<0.01图4 各组细胞中HAUSP、NANOG蛋白的表达水平Fig.4 Expression levels of HAUSP and NANOG protein in each group

与空白对照组(NC)比较，*P<0.05 **P<0.01图5 各组细胞增殖能力Fig.5 Cell proliferation in each group

图6 各组细胞的细胞周期Fig.6 Cell cycle in each group

与空白对照组(NC)比较，*P<0.05 **P<0.01图7 各组胶质瘤细胞的凋亡率Fig.7 Apoptosis rate of glima cells in each group

3 讨论

胶质瘤目前仍是死亡率较高的恶性肿瘤之一，由于其恶性增殖和侵袭性生长的特性，复发率、死亡率高，预后差，因此无论是手术治疗，还是放疗、化疗，都无法彻底治愈[6-7]。随着肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)研究的深入，目前已成功从胶质瘤组织和细胞系中分离鉴定出胶质瘤干细胞，并认为胶质瘤干细胞与胶质瘤的恶性程度、耐药性、复发和侵袭性生长密切相关[8-10]。而转录因子在维持干细胞全能性中起核心作用，直接决定干细胞分化与否，在肿瘤的恶性进展中起到关键性作用，因此，精确调控维持干细胞多向分化潜能的转录因子的功能至关重要。

HAUSP作为去泛素化酶，可介导底物蛋白的去泛素化，影响蛋白的泛素化水平，从而调节蛋白的稳定性、核定位以及转录因子的转录活性，主要可分为p53依赖途径和p53非依赖途径。在不同的肿瘤或细胞系中HAUSP介导的去泛素化水平不同，因此表现出不同的生物学特性[11]。

研究发现[3-5]，在人脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞U87中，HAUSP与NANOG均有表达，两者表达均与胶质瘤级别有关，且两者表达具有正相关性，在胶质瘤细胞中两者具有共同的核定位，提示NANOG作为核内转录因子，与HAUSP相互作用，共同影响肿瘤细胞的增殖，维持肿瘤细胞的干细胞特性。

NANOG的高表达可维持胶质瘤细胞的低分化或未分化状态[12]。但NANOG蛋白是一个极不稳定蛋白，半衰期短，在胚胎干细胞中其可通过泛素-蛋白酶体途径(UPP)降解，NANOG蛋白的翻译后泛素化和去泛素化修饰对于其蛋白水平稳定性和生物学活性进行着精确的调控[13]。HAUSP作为去泛素化酶，能催化水解泛素分子C-末端的肽链连接，发挥去泛素化作用，参与蛋白调控及影响转录因子的核定位及降解，尤其可特异性地识别和结合具有P/AxxS基序的蛋白[13]。通过GenBank检索NANOG蛋白的氨基酸序列显示NANOG蛋白具有多个P/AxxS基序，为HAUSP与NANOG可以相互作用提供了蛋白结构基础，且分析发现数个P/AxxS基序位于NANOG蛋白N-端的PEST序列之内。此序列可以介导NANOG蛋白的泛素化使其降解，而PEST序列的缺失可以避免NANOG蛋白的泛素化而稳定NANOG蛋白[13-14]。

为进一步探讨HAUSP调控网络在胶质瘤中的作用，本实验通过改变HAUSP在胶质瘤细胞中的表达水平研究胶质瘤细胞生物学活性的变化。本实验结果显示：在不同类型胶质瘤细胞系中，利用病毒载体转染手段，上调HAUSP的表达，NANOG蛋白水平上调，同时伴有细胞增殖能力增强，但NANOG基因的mRNA水平未见明显变化；反之，下调HAUSP的表达，NANOG蛋白水平也下调，同时伴有细胞增殖能力减弱，但NANOG基因的mRNA水平未见明显变化。结合前期研究[14-16]表明，HAUSP对肿瘤细胞影响均是通过去泛素化修饰底物蛋白完成，在胶质瘤细胞中可能作用于NANOG蛋白来维持细胞的低分化状态。具体机制可能是通过HAUSP与NANOG蛋白所具有的P/AxxS基序直接结合，维持NANOG蛋白的去泛素化状态，而避免NANOG蛋白降解，维持胶质瘤细胞的低分化状态和胶质瘤干细胞的多向分化潜能，与胶质瘤恶性进展可能密切相关。

综上所述，本研究表明调控胶质瘤细胞中HAUSP的表达可影响肿瘤细胞生物学活性，HAUSP与特定基序结合维持NANOG蛋白的去泛素化状态，抑制了NANOG蛋白的降解是其可能的作用机制。高水平HAUSP抑制了NANOG蛋白的降解而使胶质瘤细胞处于低分化或未分化状态，是胶质瘤恶性进展的可能因素。因此，抑制HAUSP蛋白去泛素化活性可作为治疗脑胶质瘤的潜在途径，同时针对HAUSP与NANOG蛋白的特定结合基序的研究将成为今后胶质瘤研究的新方向。

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EffectsofHAUSPExpressionontheProliferationandApoptosisofGliomaCells

Cheng Chuandong，Niu Chaoshi△，Dong Yongfeietal

DepartmentofNeurosurgery，AnhuiProvincialHospital，AnhuiProvinceKeyLaboratoryofBrainFunctionandBrainDisease，AnhuiProvincialStereotacticNeurosurgicalInstitute，Hefei230001，China

ObjectiveTo investigate the function and possible mechanisms of HAUSP expression on the proliferation and apoptosis of glioma cells.MethodsHAUSP overexpression and low expression plasmids were constructed and transfected U87 and U251 cell lines by virus vector.Real-time reverse-transcription PCR and Western blotting were utilized to detect mRNA levels and protein expression of HAUSP and NANOG in theglioma cells，respectively.The abilities of cellular proliferation and apoptosis were measured by mosmanntetrazolium test(MTT)assay and flow cytometry(FCM).ResultsHAUSP overexpression and low expression U87 and U251 cell lines were constructed successfully.In HAUSP overexpression group，we found an obvious increase in the mRNA and protein expression levels of HAUSP compared to the control group.Simultaneously，the mRNA of NANOG was not significantly different，but NANOG protein increased obviously，which increased the proliferation of glioma cells and reduced the apoptosis of those cells.In HAUSP lowexpression group，we found an obvious decrease in the mRNA and protein expression level of HAUSP as compared to the control group.Simultaneously，the mRNA of NANOG was not significantly different，but NANOG protein decreased obviously，which decreased the proliferation of glioma cells and increased the apoptosis of those cells.ConclusionHAUSP overexpression can promote the proliferation of glioma cells and increase NANOG protein level.Therefore，HAUSP may maintain the proliferation activity of glioma cells by maintaining deubiquitination of NANOG.

glioma； HAUSP； NANOG； deubiquitinating； cancer stem cell

*安徽省自然科学基金青年项目(No.1508085QH184)

程传东，男，1985年生，主治医师，博士研究生，E-mail：doctorcd@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：niuchaoshi@126.com

R739.41

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.004

(2017-08-23 收稿)