sPLA2-ⅠB、PLA2R及PLA2R-AB在鉴别微小病变型肾病及特发性膜性肾病中的意义*

潘阳彬， 万建新， 陶 璇， 邹臻寰， 徐 卿， 刘亚惠， 杨丽燕， 柯鸿婷

福建医科大学附属第一医院 1肾内科 2病理科，福州 350005 3福建医科大学附属南平第一医院肾内科，南平 353000

sPLA2-ⅠB、PLA2R及PLA2R-AB在鉴别微小病变型肾病及特发性膜性肾病中的意义*

潘阳彬1， 万建新1， 陶 璇2， 邹臻寰1， 徐 卿3， 刘亚惠1， 杨丽燕1， 柯鸿婷1

福建医科大学附属第一医院1肾内科2病理科，福州 3500053福建医科大学附属南平第一医院肾内科，南平 353000

目的检测分泌型磷脂酶A2-ⅠB(sPLA2-ⅠB)、M型磷脂酶A2受体(PLA2R)及抗M型磷脂酶A2受体抗体(PLA2R-AB)在微小病变型肾病(MCD)及特发性膜性肾病(IMN)中的表达，为临床上鉴别两类疾病寻找新的生物学检测指标。方法收集临床表现为肾病综合征并经肾穿刺病理检查证实为MCD(16例)及IMN(29例)患者的血清、尿液及肾脏病理标本。检测血清各项生化指标及尿蛋白定量，间接免疫荧光检测血清PLA2R-AB表达水平，免疫荧光检测肾小球PLA2R表达水平，ELISA检测血清sPLA2-ⅠB表达水平，免疫组化检测肾小球sPLA2-ⅠB表达水平。分析sPLA2-ⅠB、PLA2R及PLA2R-AB水平在MCD组及IMN组中的表达情况。结果IMN组患者血清PLA2R-AB阳性率为69.0%，MCD组患者血清PLA2R-AB均为阴性(P<0.01)。IMN组肾小球足细胞PLA2R阳性率为86.2%，MCD组肾小球足细胞PLA2R阳性率为18.8%(P<0.01)。IMN组及MCD组血清sPLA2-ⅠB平均水平分别为(211.04±69.47)、(184.52±33.29)pg/mL(P>0.05)。IMN组和MCD组肾小球sPLA2-ⅠB的平均积分吸光度值分别为(1 849.90±506.07)、(1 143.63±323.68)(P<0.01)。结论sPLA2-ⅠB、PLA2R及PLA2R-AB在MCD及IMN中表达有明显差异。联合检测sPLA2-ⅠB、PLA2R及PLA2R-AB有助于提高MCD及IMN的鉴别诊断水平。

膜性肾小球肾炎； 微小病变型肾病； 磷脂酶A2； 鉴别诊断

肾小球足细胞病包括微小病变型肾病(minimal changed disease，MCD)、膜性肾病(membranous nephropathy，MN)及局灶节段性肾小球硬化肾病(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)等。膜性肾病又包括特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)及继发性膜性肾病(secondary membranous nephropathy，SMN)。既往鉴别肾小球足细胞病均需通过肾穿刺病理检查。然而，自Beck等[1]发现抗M型磷脂酶A2受体抗体(M-type phospholipase A2 receptor antibody，PLA2R-AB)是IMN患者体内的主要自身抗体以来，鉴别IMN就多了一个检测手段，即可以通过检测血清PLA2R-AB来帮助鉴别IMN及其他类型肾病。遗憾的是，仅仅通过检测PLA2R-AB仍然不能确诊IMN。有研究发现M型磷脂酶A2受体(M-type phospholipase A2 receptor，PLA2R)在IMN肾小球足细胞表达增加[2]，分泌型磷脂酶A2-ⅠB(secretory phospholipase A2-ⅠB，sPLA2-ⅠB)在慢性肾衰竭患者体内也表达增加[3]，sPLA2-ⅠB是否在IMN中也具有特异性表达增加，目前尚未见报道。PLA2R、sPLA2-ⅠB及PLA2R-AB三者结合检测是否能鉴别IMN与其他类型肾病也未见报道。而早期IMN与MCD更加难以鉴别，故本研究拟检测IMN与MCD患者PLA2R、sPLA2-ⅠB及PLA2R-AB，探讨3项指标对以上2种肾病的鉴别诊断是否有意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2016年1月至2017年5月在福建医科大学附属第一医院住院经肾活检诊断为IMN及MCD的成人患者45例，其中IMN 29例，MCD 16例。将患者分为IMN组及MCD组。IMN组男性16例，女性13例，平均年龄(51.24±13.25)岁。MCD组男性8例，女性8例，平均年龄(48.75±18.89)岁。所有患者均符合以下要求：①临床表现为肾病综合征，初诊或就诊前期未接受过激素及免疫抑制剂治疗；②肾穿刺病理检查前无急性肾损伤发生；③肾脏病理类型均经肾穿刺病理检查确诊；④排除继发性肾脏疾病如高血压肾病、糖尿病肾病、狼疮性肾炎等；⑤无肾毒性药物及毒物接触史，并排除合并有严重血液系统、心、脑、肺等疾病。本研究所遵循的程序符合伦理学要求，并经本院伦理委员会批准。所有参试者均签署知情同意书。

1.2 一般临床资料的收集

包括年龄、性别、身高、体重、血压、现病史、既往史等。并收集实验室指标，包括血常规、尿常规、24 h尿蛋白量、肾功能、肝功能、血脂、血糖、肿瘤指标、免疫学指标等资料。

1.3 肾脏病理标本收集及检测

B型超声引导下行肾穿刺活检，肾活检组织分别行光镜、免疫荧光及免疫组化检测。

1.3.1 光镜下检测 光镜标本进行石蜡包埋，切片厚2 μm，分别行HE、PAS、PASM染色。

1.3.2 免疫荧光下检测 ①直接免疫荧光法检测IgG、IgA、IgM、C3、C1q表达：将冰冻切片置于抽湿机器旁室温干燥30 min后滴加标记荧光抗体，将切片置于湿盒内。37℃孵育1.5 h、4℃过夜。PBS轻洗3次，每次2 min。防淬灭荧光封片剂封片，于4℃冰箱避光放置。用荧光显微镜(日本OLYMPUS)观察。②间接免疫荧光法检测肾组织PLA2R表达：将冰冻切片置于抽湿机旁室温干燥30 min。滴加一抗将切片置于湿盒内(一抗浓度1∶100，英国Abcam公司)。37℃孵育1.5 h。PBS轻洗3次，每次2 min。滴加荧光素标记的二抗IgG抗体。37℃孵育1.5 h。PBS轻洗3次，每次2 min。防淬灭荧光封片剂封片，于4℃冰箱避光放置。用荧光显微镜观察肾组织PLA2R表达水平。

1.3.3 免疫组化检测 所有肾活检标本均采用免疫组织化学法行sPLA2-ⅠB检测。肾穿刺标本经烤片，脱蜡，水化,切片，高压修复后，3% H2O2去离子水室温孵育8 min，PBS冲洗3次，滴加一抗sPLA2-ⅠB抗体(一抗浓度1∶200，美国Sigma-Aldrich公司)，4℃过夜。次日37℃烤箱内复温30 min后PBS液漂洗5 min×3次，将玻片重新置入湿盒内。滴加二抗(1∶5 000)于37℃静置30 min后PBS液漂洗5 min×3次。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，于37℃静置15 min后PBS漂洗5 min×3次。再经DAB显色、苏木精复染、盐酸乙醇分化、梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，中性树胶封片并室温晾干后于显微镜下观察并摄片。Image-pro plus软件分析免疫组化积分吸光度值。

1.4 血清标本收集及检测

收集肾穿刺当日清晨空腹静脉血5 mL，3 000 r/min，离心10 min，取上清液保存在-80℃备用。

1.4.1 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清sPLA2-ⅠB水平 在空白孔中加入100 μL样品稀释液，其余孔分别加入100 μL标准品或待测样品。覆膜，37℃孵育90 min。弃去液体，甩干，每孔中加入Detection Ab 100 μL工作液，酶标板加上覆膜，37℃温育1 h。弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，约350 μL /孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。每孔加入HRP Conjugate 100 μL工作液，加上覆膜，于37℃温育30 min。弃去孔内液体并甩干，洗板5次。每孔加入90 μL底物溶液，酶标板加上覆膜于37℃避光孵育15 min。加入终止液终止反应后立即使用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度(A)值。

1.4.2 采用间接免疫荧光法检测血清PLA2R-AB水平 采用德国EUROIMMUN生物技术有限公司提供的抗PLA2R-AB检查试剂盒，按以下程序进行操作：血清稀释后加入试剂盒抗原基质片，于室温孵育30 min后清洗5 min，然后加入FITC标记的羊抗人IgG，室温避光孵育30 min，清洗5 min，加甘油封片后荧光显微镜下判读结果，以抗体滴度≥1∶10为弱阳性(+)，抗体滴度≥1∶320为强阳性()，介于两者之间者为阳性()。

1.5 统计学处理

正态分布计量资料以均数±标准差表示，非正态分布计量资料以M(1/4，3/4)表示，正态分布资料比较采用t检验，非正态分布资料采用Wilcoxon秩和检验。计数资料以频数和百分比表示，无序分类变量采用卡方检验或Fisher精确概率法检验，有序分类变量采用Wilcoxon秩和检验。采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IMN组及MCD组临床资料比较

与IMN组患者比较，MCD组患者虽然年龄较小，但两组肾脏病患者间年龄差异无统计学意义(P>0.05)，纳入的IMN组中男性16例，女性13例，MCD组中男性8例，女性8例，两组间血压、血清白蛋白、胆固醇、三酰甘油、肌酐及尿蛋白定量比较差异均无统计学意义。见表1。

2.2 IMN组及MCD组病理资料比较

IMN组基底膜增厚比例较MCD组明显较多(P<0.01)，IMN组嗜复红蛋白沉积较多，肾小管萎缩/间质纤维化及间质炎性细胞浸润较MCD组明显(均P<0.05)。免疫荧光检测结果显示IMN组IgG及C3沉积强度较MCD组明显增强(均P<0.01)。但系膜细胞及基质增生、肾小球节段硬化、毛细血管内细胞增生比例两组间差异无统计学意义。见图1及表2。

2.3 IMN组及MCD组血清PLA2R-AB水平和肾穿刺活检病理组织PLA2R水平的比较

29例病理诊断为IMN的患者中20例血清PLA2R-AB阳性，阳性率为69.0%，16例病理诊断为MCD的患者中血清PLA2R-AB均为阴性，两组间差异有统计学意义(P<0.01)。IMN组肾小球足细胞PLA2R免疫荧光检测有25例阳性表达，阳性率为86.2%，MCD组肾小球足细胞PLA2R免疫荧光检测有3例阳性表达，阳性率为18.8%(P<0.01)。见表1及图1。

2.4 IMN组及MCD组血清sPLA2-ⅠB水平和肾穿刺活检病理组织sPLA2-ⅠB水平的比较

ELISA检测显示，IMN组及MCD组血清sPLA2-ⅠB平均水平分别为(211.04±69.47)、(184.52±33.29)pg/mL，两组间差异无统计学意义。免疫组化染色显示，IMN组肾小球sPLA2-ⅠB的平均积分吸光度值为(1 849.90±506.07)，MCD组肾小球sPLA2-ⅠB平均积分吸光度值为(1 143.63±323.68)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)。见表1及图1。

表1 两组临床资料及PLA2R、PLA2R-AB、sPLA2-ⅠB的表达水平比较Table 1 Clinical data of two groups and the levels of PLA2R，PLA2R-AB and sPLA2-ⅠB (±s)

A：IMN肾小球PASM染色，见基底膜增厚(×400)；B：IMN肾小球PLA2R免疫荧光染色，见PLA2R沿基底膜呈阳性表达(×400)；C：IMN肾小球sPLA2-ⅠB免疫组化染色，见sPLA2-ⅠB强阳性表达(×400)；D：MCD肾小球PASM染色，见基底膜无明显增厚(×400)；E：MCD肾小球PLA2R免疫荧光染色，未见PLA2R阳性表达(×400)；F：MCD肾小球sPLA2-ⅠB免疫组化染色，见sPLA2-ⅠB弱阳性表达(×400)图1 微小病变肾病及特发性膜性肾病病理特征及PLA2R、sPLA2-ⅠB表达水平Fig.1 The pathological feature of IMN and MCD and the levels of PLA2R and sPLA2-ⅠB of two groups

2.5 肾组织sPLA2-ⅠB水平与血清白蛋白及24 h尿蛋白定量间相关性分析

相关性分析显示，IMN组肾组织sPLA2-ⅠB水平与血清白蛋白间呈负相关(r=-0.380，P=0.042)，与24 h尿蛋白定量间无相关性(r=0.305，P=0.108)；MCD组肾组织sPLA2-ⅠB水平与血清白蛋白及24 h尿蛋白定量间均无相关性(r=-0.141，P=0.602；r=0.374，P=0.154)。相关性分析散点图见图2。

表2 微小病变肾病及特发性膜性肾病患者肾活检病理特征比较[例(%)]Table 2 Pathological data of IMN patients and MCD patients[n(%)]

A：IMN肾小球sPLA2-ⅠB积分吸光度值与血清白蛋白(Alb)水平相关性散点图(P<0.05)；B：IMN肾小球sPLA2-ⅠB积分吸光度值与24 h尿蛋白(Upro)水平相关性散点图(P>0.05)；C：MCD肾小球sPLA2-ⅠB积分吸光度值与血清白蛋白(Alb)水平相关性散点图(P>0.05)；D：MCD肾小球sPLA2-ⅠB积分吸光度值与24 h尿蛋白(Upro)水平相关性散点图(P>0.05)图2 微小病变型肾病及特发型膜性肾小球sPLA2-ⅠB与血清白蛋白、尿蛋白水平相关性散点图Fig.2 The scatter diagram of association of sPLA2-ⅠB with albumin or urine protein in the two groups

3 讨论

肾脏病理检查的应用使IMN与MCD的诊断准确率获得很大提高，但即使如此，早期IMN与MCD仍难以完全鉴别，临床上仍出现早期肾脏病理表现为MCD而发展为IMN的情况。故探讨采用肾脏病理检查之外的生物学指标来鉴别两类疾病显得尤为重要。

M型PLA2R作为IMN患者体内的特异性靶抗原，近年来已有较多研究证明其可用于IMN与其他肾小球疾病的鉴别。国外研究发现肾小球中PLA2R阳性表达对诊断IMN的灵敏度为75%，特异度为83%[4]。国内的一项回顾性研究发现，102例IMN患者中肾小球PLA2R阳性率为84%[5]。我们的研究发现29例IMN患者中肾小球PLA2R阳性率为86.2%，而16例MCD患者肾小球PLA2R阳性率为18.8%。PLA2R在鉴别IMN患者方面显示出较强的特异性。

虽然目前PLA2R已被认为是鉴别IMN与其他肾小球疾病重要的生物学指标，但仍有部分IMN患者PLA2R及其血清抗体均阴性。而且近来发现在部分乙肝相关性肾炎中PLA2R阳性率高达64%，在少部分狼疮性肾炎中PLA2R也阳性表达[5]。此外，Tomas等[6]发现1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)，在PLA2R-AB阴性的IMN患者血清样本中筛选出抗1型血小板反应蛋白7A域抗体(THSD7A-AB)，最终证明约2.5%～5.0%IMN患者存在THSD7A-AB。在此之后，日本的一个研究发现IMN患者肾小球中THSD7A阳性率达9.1%，且THSD7A在其他肾小球疾病及SMN中均未见表达[7]。以上研究证明PLA2R并非是IMN患者的唯一肾小球靶抗原，也证明并非只有IMN患者表达PLA2R。正因为如此，目前临床上鉴别IMN及其他肾小球疾病仍主要通过肾穿刺病理检查来确诊。

从Beck等[1]发现PLA2R-AB是IMN患者体内的主要自身抗体以来，PLA2R-AB就成为IMN研究的热点。目前对血清PLA2R-AB诊断IMN的敏感性报道有一定差异，国外研究显示灵敏度为48%～82%[8-9]。国内学者研究发现，血清PLA2R-AB水平在IMN患者中的阳性率为82%。我们的研究发现29例IMN患者中有20例血清PLA2R-AB阳性，阳性率为69.0%，而16例MCD患者中无一例血清PLA2R-AB阳性。PLA2R-AB在鉴别是否IMN方面也显示出较高的特异性。然而，研究者同时也发现在乙肝相关性肾炎、Ⅴ型狼疮性肾炎患者中PLA2R-AB也有一定的阳性率，两种疾病的阳性率分别为6.3%、5%[10]。Meta分析显示，对于IMN与SMN的鉴别诊断，血清PLA2R-AB灵敏度为68%，特异度达97%，提示PLA2R-AB血清学检测有重要的临床价值。但当血清PLA2R-AB检测阴性的患者仍需根据病理诊断来确诊[11]。因此，仍需在PLA2R及PLA2R-AB之外寻找能鉴别IMN及其他肾小球疾病的生物学指标。

sPLA2-ⅠB对PLA2R具有高度特异性亲和力。sPLA2-ⅠB可被视为PLA2R的天然配体。除其消化功能外，sPLA2-ⅠB与其PLA2R结合后影响细胞的多种生物功能，包括细胞增殖、脂肪介质的释放等等。研究发现在PLA2R敲除的小鼠中内毒素休克病情减轻，而PLA2R在内毒素休克进程中的促炎症介质释放功能起着关键作用[12]。

PLA2R结合sPLA2-ⅠB后可将其内吞入细胞，在其细胞外配体内化的过程中产生重要作用。这种内化作用可能是sPLA2-ⅠB产生生物效应的触发因素。另有研究表明，使用PLA2R的特异竞争性抑制剂Me-indoxam，可显著降低sPLA2-ⅠB与PLA2R的亲和力，并指出sPLA2-ⅠB导致的细胞凋亡及活动能力下降并非由炎症因子介导[13]。分泌型磷脂酶A2(sPLA2)，包括sPLA2-ⅠB，通常被认为是控制脂质介质释放的关键酶，然而，由于sPLA2还是PLA2R的配体，故其生物活性并不局限于催化功能[14]。在人成纤维细胞中，PLA2R能加速复制性细胞衰老的发生，部分原因是引起活性氧族的产生增加并导致DNA损伤[15]。

基础研究发现，sPLA2-ⅠB与PLA2R结合后可激活胞浆型磷脂酶A2α(cPLA2α)，cPLA2α激活时，能够利用N-末端中的钙依赖磷脂结合结构域(C2 domain)，驱动其由胞质转运到胞膜，进而水解花生四烯酸(AA)[16]。磷酸化的cPLA2α能使其酶活性增加2～4倍。在许多细胞类型中，cPLA2α通过P42/44 MAPK和/或p38 MAPK途径实现磷酸化的过程。我们前期研究也证实在足细胞中，sPLA2-ⅠB刺激足细胞后能激活P42/44 MAPK途径，导致cPLA2α磷酸化，进而引起足细胞凋亡率增加[17]。本临床研究发现，虽然IMN与MCD血清中sPLA2-ⅠB水平没有统计学差异，但IMN患者肾脏组织中的sPLA2-ⅠB表达水平明显高于MCD患者。此外，虽然IMN患者sPLA2-ⅠB与尿蛋白定量未显示出相关性，但与IMN患者血清白蛋白水平呈负相关。而MCD患者肾脏组织中的sPLA2-ⅠB表达水平与患者尿蛋白定量及血清白蛋白水平均没有相关性。显示肾脏组织中sPLA2-ⅠB表达水平可作为鉴别IMN与MCD的生物学指标。

综上所述，PLA2R及其抗体在鉴别IMN及MCD中有较高的敏感度及特异度，但仍不能完全凭PLA2R及其抗体的检测来对二者进行完全鉴别。肾脏组织中sPLA2-ⅠB表达水平在IMN中表达明显较MCD中较高，sPLA2-ⅠB可以结合PLA2R及PLA2R-AB来提高对IMN和MCD的鉴别水平。当然，本研究例数仍然较少，sPLA2-ⅠB结合PLA2R及PLA2R-AB鉴别IMN和MCD及其他肾小球疾病是否可靠，还需要大型多中心临床研究来进一步验证。

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RoleofsPLA2-ⅠB，PLA2RandPLA2R-antibodyinIdentificationofMCDandIMN

Pan Yangbin1，Wan Jianxin1，Tao Xuan2etal

1DepartmentofNephrology，2DepartmentofPathology，FirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity，Fuzhou350005，China

ObjectiveTo detect the levels of secretory phospholipase A2-ⅠB(sPLA2-ⅠB)，M-type phospholipase A2 receptor(PLA2R)and M-type phospholipase A2 receptor antibody(PLA2R-AB)in minimal changed disease(MCD)and idiopathic membranous nephropathy(IMN)and try to find new biological parameters for identifying the two diseases.MethodsTotally，45 renal disease patients diagnosed by renal biopsy were enrolled，consisting of 29 IMN and 16 MCD.Their clinical data of serum，urine and renal histopathological specimens were collected.Serum PLA2R-AB was detected by indirect immunofluorescence assay.PLA2R in glomeruli was detected by direct immunofluorescence assay.Serum sPLA2-ⅠB was measured by ELISA.And sPLA2-ⅠB in glomeruli was determined by immunohistochemistry.ResultsThe positive rate of serum PLA2R-AB was 69.0% in 29 IMN patients，while it was 0.0% in 16 MCD patients(P<0.01).Similarly，the positive rate of PLA2R in glomeruli was 86.2% in IMN patients，while it was 18.8% in MCD patients(P<0.01).Compared with the IMN patients，the MCD patients presented a significantly lower level of sPLA2-ⅠB IOD in glomeruli[(1 849.90±506.07)vs. (1 143.63±323.68),P<0.01].There was no difference in serum sPLA2-ⅠB level between the two groups[(211.04±69.47)pg/mLvs. (184.52±33.29)pg/mL,P>0.05].ConclusionThere are significant differences in sPLA2-ⅠB，PLA2R and PLA2R-AB between IMN patients and MCD patients.Joint detection of sPLA2-ⅠB，PLA2R and PLA2R-AB can help to identify IMN and MCD.

membranous glomerulonephritis； minimal changed disease； phospholipase A2； differential diagnosis

*国家自然科学基金资助项目(No.81670635)；福建省自然科学基金资助项目(No.2016J01532)；福建省卫生计生委中青年骨干人才培养项目(No.2016-ZQN-36)

潘阳彬，男，1973年生，副主任医师，医学博士，E-mail：panyb9999@126.com

R692.31

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.002

(2017-07-18 收稿)