巯基-烯复合物与巯基交换反应的可控调节

张宝秀，张淑萍，苏 静

（长治学院 化学系，山西 长治 046011）

巯基-烯复合物与巯基交换反应的可控调节

张宝秀，张淑萍，苏 静

（长治学院 化学系，山西 长治 046011）

合成了两种不同pKa巯基的巯基-烯复合物模板分子EtSCN2和PhSCN2，通过超高效液相色谱研究了50 M的模板分子与1 mM还原型谷胱甘肽的反应动力学，二者与GSH加成-消除反应的Halflife分别为14.8 min和1.5 min，相差将近十倍。初步实现了巯基与巯基-烯复合物的交换反应的动力学控制。

巯基；交换反应；动力学控制

1 引言

作为调控细胞内外氧化还原环境、维持蛋白二级结构的重要物种[1-6]，GSH含量变化与老年痴呆症、癌症、心脑血管疾病等多种疾病有关，是细胞内最丰富的硫醇小分子（1-10 mmol/L）[7]，但其在肿瘤组织细胞外的浓度仅为1-10 μmol/L8],因此根据肿瘤细胞内外谷胱甘肽含量的差异，很多含有可被巯基交换的含硫药物递送体系被设计出来。但是不同的肿瘤组织微环境内巯基物种的含量是不同的，为了能够根据需要释放药物或者探针分子，需要调控巯基交换的反应性能，但是目前为止调控巯基交换性能的工作还鲜有报道。文章以巯基-烯烃复合物为母体，通过调节含有不同pKa的巯基连接单元，初步实现了交换反应的动力学控制。

2 实验部分

2.1 实验仪器和试剂

对羧基苯硫酚（AR），丙二腈（AR），原戊酸三甲酯（AR），无水乙腈（AR），三乙胺（AR），碳酸氢钠（AR），无水乙醚。

Waters半制备型色谱仪，Bruker AV 500 MHz核磁共振仪，Esquire 3000 plus电喷雾离子肼质谱仪，Waters超高效液相色谱仪。

2.2 模型分子的合成与表征

（1）2-（甲氧基苯基）亚甲基）丙二腈（MeOCN2）的合成

图1 MeOCN2合成路线

0.66 g（10 mmol）溶于5 mL乙酸酐，搅拌下加入1.62 g（10 mmol）原戊酸三甲酯，体系回流反应15 h，冷却至室温后用水稀释，混合液用乙醚萃取三次，有机相用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸后得到目标产物1.39 g，产率75%；1H NMR（500 MHz,DMSO）δ 7.74-7.60（m, 5H），3.89（s,3H）.MS（m/z）184.25（M+H）+.（2）2-（乙硫基苯基）亚甲基）丙二腈（EtSCN2）的合成

图2 EtSCN2合成路线

将90 mg（0.5 mmol）化合物1和63 mg（1 mmol）乙硫醇溶于2 ml无水乙腈，加入200 mL三乙胺，室温下搅拌过夜，制备色谱分离纯化；MS（m/z）214.35（M+H）+。（3）2-（对羧基苯硫酚基苯基）亚甲基）丙二腈（PhSCN2）的合成

图3 PhSCN2合成路线

将90 mg（0.5 mmol）化合物1和154 mg（1 mmol）乙硫醇溶于2 mL无水乙腈，加入200 L三乙胺，室温下搅拌过夜，制备色谱分离纯化；MS（m/z）306.10（M+H）+。

2.3 实验方法

合成了两种具有不同巯基释放活性的药物载体分子，通过核磁和质谱表征了其结构，通过液相色谱仪研究了双键上不同pKa的巯基取代载体作为受体单元与GSH的反应动力学。

2.3.1 溶液配制

（1）10 mmol/L EtSCN2母液的配制：称量4.3 mg，溶于2 mL乙腈；（2）10 mmol/L PhSCN2配制：称量6.1 mg，溶于2 mL乙腈；（3）称量39 mg还原型谷胱甘肽（GSH）溶于5 mL纯水（氮吹去氧）中；（4）PB（100 mmol/L，pH=7.4）：A液（0.2 M Na2HPO4）配制：称量14.32 g Na2HPO4-12H2O，溶于200 ml纯水；B液 （0.2M NaH2PO4） 配制：称取 6 g NaH2PO4-2H2O，溶于200 mL纯水，将38 mL B液和162 mL A液混合，并用纯水稀释一倍，用pH测定仪测定pH，NaOH和HCl溶液调节pH=7.4，本文所使用缓冲液均为该缓冲液。

2.3.1 GSH取代动力学实验

在两个1.5 mL的离心管离用乙腈分别从母液稀释配制200 mol/L的EtSCN2溶液与200 mol/L的 PhSCN2溶液各 500L。从母液稀释得到 4 mmol/L谷胱甘肽的PB溶液于1.5 mL离心管中。分别取500 L GSH加入到200 mol/L的EtSCN2溶液与200 mol/L的PhSCN2溶液中去并开始计时。小分子最终浓度为50mol/L，GSH最终浓度为1 mmol/L。分别在计取点时间时取两溶液各50 μL加入到10%偏磷酸中猝灭反应，并使用UPLC监测反应进程。

3 结果与讨论

图4 50 mol/L EtSCN2与1 mml/L GSH反应动力学

首先考察了乙硫醇作为取代基团时1 mmol还原型谷胱甘肽对模板分子EtSCN2的取代动力学。该模板分子是由乙硫醇与与MeOCN2通过亲核加成-消除反应所得，由于乙硫醇具有较大的pKa值，巯基活性较低，当其作为亲核试剂加成并消除掉甲氧基形成新的巯基-烯烃取代产物后，双键碳上电子云密度较大，GSH作为新的亲核试剂加成到双键上较为困难。同时当GSH的加成产物形成后，由于较高的pKa，乙硫醇离去较为困难，因此在动力学上表现为较大的半衰期。其取代半衰期Halflife为14.38 min，完全释放用时两个多小时，如果我们选取具有更高pKa的巯基取代物作为连接药物的连接单元，会得到更久的释放动力学。

图5 50 mol/L EtSCN2与1 mml/L GSH反应动力学

作为对照，接下来考察了苯硫酚作为取代单元时（PhSCN2）体系对1 mmol还原型谷胱甘肽的反应动力学。苯硫酚相较于乙硫醇具有更低的pKa（pKa=7.8），其巯基活性更高，作为离去基团时也更容易离去。但是相较于乙基，苯环具有更大的刚性和体积，因此当GSH作为亲核试剂进攻时，位阻会稍大于乙硫醇，这不利于反应的进行，两者综合起来如图5所示。相较于EtSCN2，苯硫酚的低pKa使得该模板分子与GSH有更快的反应动力学，其取代半衰期Halflife=1.5 min，完全释放用时不到十分钟，这比EtSCN2快了10倍左右。

4 总结与展望

通过调控双键上连接键巯基的pKa和位阻，能够进而调控其作为载体时修饰的药物或探针分子的释放行为，这为利用生命体系细胞内外，不同组织，不同细胞器巯基物种多少的差异来实现可控、原位释放药物或者携带探针荧光成像提供了理论依据和实验支持。

［1］GO Y M,JONES D P.Biochimica et Biophysica Acta,2008,1780（11）:1273-1290.

［2］CIRCU M L,AW T Y.Free Radical Biology& Medicine,2010,48（6）:749-762.

［3］CAIRNS R A,HARRIS I S,MAK T W. Nature Reviews Cancer,2011,11（2）:85-95.

［4］Peng H J,Chen W X,Cheng Y F,et al.Sensors, 2012,12:15907-15946.

［5］CASTALDO S A,FREITAS J R,CONCHINHA N V,et al.Oxidative Medicine and Cellular Longevity,2016,2016（3）:1-17.

［6］BRULISAUER L,GAUTHIER M A,LEROUX J C.Journal of Controlled Release,2014,195: 147-154.

［7］CHAISWING L,OBERLEY T D.Antioxidants &Redox Signaling,2010,13（4）:449-465.

［8］SCHAFER F Q,BUETTNER G R.Free Radical Biology&Medicine,2001,30（11）:1191–1212.

The Dynamic Control of the Exchange Reaction between Sulfhydryl and Mercapto-ene Compounds

Zhang Bao-xiu,Zhang Shu-ping,Su Jin
（Department of Chemistry Changzhi University,Changzhi Shanxi 046011）

Two mercapto-ene compounds with different pKa of thiol were synthesized.The reaction kinetics of 50 M molecular templates with 1 mM GSH was then studied by UPLC and the results showed that there was a ten times difference in Halflife with 14.8 min and 1.5 min.The dynamic control of the exchange reaction between sulfhydryl andmercapto-ene compound is preliminarily implemented.

thiol;exchange reaction;dynamic control

O62

A

1673-2014（2017）05-0021-03

长治学院校级课题（201417）；山西省大学生创新创业训练项目（2014432）

2017—06—11

张宝秀（1964— ），女，山西陵川人，高级实验师，主要从事药物化学方面研究。

（责任编辑 周成勇）