丙酮酸乙酯对鱼藤酮诱导的多巴胺能神经细胞损伤的保护作用

熊婧 胡丹 张振涛 张兆辉

·论 著·

丙酮酸乙酯对鱼藤酮诱导的多巴胺能神经细胞损伤的保护作用

熊婧 胡丹 张振涛 张兆辉

目的建立鱼藤酮(Rotenone, Rot)诱导的SH-SY5Y细胞模型，探讨丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate，EP)对多巴胺能神经细胞的保护作用及机制。方法Rot作用于SH-SY5Y细胞，构建Rot诱导的PD细胞模型，使用不同浓度的EP作用于PD细胞模型，MTT法检测细胞活力，Annexin V/PI染色检测细胞凋亡，免疫印迹法检测LC3 Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白的表达，免疫荧光染色观察HMGB1的表达及定位。结果EP减轻了Rot引起的多巴胺能神经细胞凋亡，并提高了细胞活力；EP减少了Rot诱导的LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表达比例增高，增加P62蛋白的表达，且与EP的水平呈正相关。激光共聚焦显微镜观察到EP抑制了HMGB1的胞浆转位。结论EP可能通过抑制HMGB1的转位来减少Rot诱导的自噬性损伤，从而对多巴胺能神经细胞起到保护作用。

丙酮酸乙酯 帕金森病 自噬 高迁移率族蛋白1

帕金森病是中老年人群常见的神经变性疾病，目前的治疗方法主要为多巴胺替代治疗，而长期使用多巴胺将会引起患者出现异动症、疗效减退等反应，尚缺乏特效的药物治疗及有效的神经保护治疗措施。寻找一种对多巴胺能神经元有保护作用的药物一直是PD研究的热点。丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate，EP)是一种丙酮酸的酯类衍生物，可作为食品添加剂使用，近年来研究发现EP具有抗氧化、抗炎、抑制或者增强凋亡、调节自噬溶酶体途径、抑制肿瘤生长等作用[1]。本研究将在鱼藤酮(Rotenone, Rot)诱导的SH-SY5Y细胞中观察EP对多巴胺能神经细胞的保护作用，并将进一步检测自噬活性及高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1, HMGB1)的表达水平来探明EP发挥保护作用的机制。

1 材料及方法

1.1 主要材料及试剂

人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)购自武汉大学典型培养物储藏中心；EP、兔抗微管相关蛋白轻链3多克隆抗体(anti-LC3B)及兔抗P62多克隆抗体购自美国sigma公司，小鼠抗HMGB1抗体购自Abcam公司，罗丹明(Tritc)标记羊抗小鼠荧光二抗，Hoechst 33258染料购自ProteinTech Group 公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Amresco公司；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购自美国Bender Medsystem公司。

1.2 细胞培养及分组

SH-SY5Y细胞置于DMEM/F12培养基中，内含10%(体积分数)灭活胎牛血清，37 ℃含5%CO2的细胞培养箱中培养，隔天换液。实验分组：对照组，Rot(2.5 μM)组，EP(5 mM)+Rot组及EP(10 mM)+Rot组。不同水平的EP预处理30 min后加入Rot作用24 h，细胞用于检测。

1.3 MTT检测细胞活力

控制细胞密度约为2×105/mL，以100 μL/孔接种于96孔板，细胞贴壁生长至80%左右，加入药物处理，各组设6个复孔；药物作用24 h后每孔加入5 mg/mL MTT 溶液10 μL，37 ℃避光培养4 h，弃上清，之后加入DMSO，37 ℃培养20 min至颗粒完全溶解；在酶标仪上测定吸光度【OD】值，吸收波长为570 nm，滤光片波长为625 nm。OD值作为反映细胞活性或代谢状态的参数，细胞存活率=实验组OD均值/对照组OD均值×100%。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

SH-SY5Y细胞经Rot处理24 h后使用不含EDTA的胰酶消化并收集细胞，使用预冷的PBS洗涤细胞2遍，之后制成单细胞悬液，取100 μL细胞悬液，分别加入5 μL Annexin-V/FITC和10 μL PI溶液，加入buffer缓冲液制成400 μL的反应体系，混合后室温避光孵育15min，通过流式细胞仪检测早期细胞凋亡。

1.5 免疫印迹法检测

SH-SY5Y细胞经处理后收集细胞，加入细胞裂解液后置于冰上裂解30 min，4 ℃下以12000 r/min离心15 min，取上清液，BCA法测定蛋白水平后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF膜上，之后分别加入兔抗LC3B、P62抗体4 ℃孵育过夜，之后使用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h后显色、曝光。

1.6 免疫荧光细胞染色

制备细胞爬片，药物处理24 h后弃培养基，随后漂洗，4%多聚甲醛固定，之后破膜，5%BSA封闭，之后分别加入小鼠抗HMGB1(1∶500)抗体于4 ℃孵育过夜，复温后加入FITC标记的羊抗小鼠荧光二抗37 ℃孵育1 h，之后Hoechst33258染色10 min，封片，固定，激光共聚焦显微镜下观察。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 EP对细胞活力的影响

SH-SY5Y细胞经Rot处理24 h后细胞活力下降至对照组的(61.23±3.12)%，而使用EP 5 mM及10 mM预处理后再暴露于Rot的细胞活力分别为对照组的(78.23±4.08)%和(82.76±2.98)%，与Rot组比较细胞活力有所提高(P<0.05)(图1)。

图1 EP对细胞活力的影响 与对照组比较,*P<0.05;与Rot组比较,#P<0.05

2.2 EP对Rot作用后细胞凋亡的影响

Rot作用24 h后SH-SY5Y细胞凋亡率增加至(20.15±2.16)%，显著高于对照组(P<0.05)，而使用EP 5 mM及10 mM预处理后均显著降低Rot诱导的细胞凋亡(P<0.05)(图2)。

2.3 EP对自噬相关蛋白表达的影响

Rot处理SH-SY5Y细胞24 h后LC3 Ⅱ/Ⅰ的比例较对照组明显增高，自噬降解底物P62的蛋白水平也增高(P<0.05)；使用EP 5 mM及10 mM预处理后LC3 Ⅱ/Ⅰ的比例较Rot组降低，而P62蛋白水平较Rot组明显增高(P<0.05)(图3)。

图2 EP对细胞凋亡的影响 与对照组比较,*P<0.05;与Rot组比较,#P<0.05

2.4 EP对HMGB1表达定位的影响

对照组细胞中HMGB1均匀分布在细胞核中，而Rot处理24 h后HMGB1向胞浆及细胞外转移，并形成颗粒样聚集物；EP10 mM预处理组HMGB1也存在胞浆转位及少量颗粒样聚集物，但较Rot组少(图4)。

3 讨 论

PD的发病机制目前尚未完全明确，既往研究提示氧化应激、线粒体功能障碍、蛋白质异常折叠和聚集、凋亡、自噬溶酶体系统异常及炎症反应等均参与PD的发病[2]。EP是一种稳定的丙酮酸酯质衍生物，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基及调节自噬、凋亡的作用[1]，因此推测EP可能对多巴胺能神经细胞具有保护作用。为证实该推测，本研究建立了鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞模型，发现EP可以减轻鱼藤酮引起的多巴胺能神经细胞凋亡，并能提高细胞活力，提示EP对PD细胞模型具有保护作用。同时通过对自噬相关蛋白的检测及HMGB1表达及定位的观察发现EP可能通过抑制HMGB1的胞浆转位来减轻PD细胞模型的自噬损伤而发挥保护作用。

EP是一种具有芳香气味的丙酮酸酯质衍生物，具有高稳定性，被美国FDA批准为可用于食品的添加剂。研究表明EP具有较强的抗氧化活性及抗炎作用，它一方面有效地清除氧自由基而起到抗氧化作用[3]；另一方面通过抑制一氧化氮、NF-κB等促炎因子的释放起到抑制炎症反应的作用，对很多缺血再灌注损伤及化脓性炎症反应模型都能起到保护作用[4-5]；EP还具有很强的抑癌作用[6]。另外，EP由于其脂溶性，可以穿透血脑屏障，作用于中枢神经系统，腹腔注射的EP可以改善LPS诱导的大鼠脑白质损伤[7]，同时也可以减轻大鼠急性脑缺血引起的脑组织缺血缺氧性损伤[5]，具有神经保护作用。有研究发现EP可以通过抑制COX-2、IL-1β及TNF-α等炎性因子的释放而减轻红藻氨酸对大鼠海马神经元的损伤[8]，从而改善大鼠的记忆功能。既往的研究也发现EP对PD模型具有保护作用，EP可以通过调节ERK的磷酸化来保护多巴胺能神经细胞免受MPTP诱导的损伤[9]。本研究也证实了EP可以减少Rot诱导的多巴胺能神经细胞凋亡，提高细胞活力，起到神经保护作用。

图3 EP对LC3、P62蛋白表达的影响 与对照组比较,*P<0.05;与Rot组比较,#P<0.05

图4 EP对HMGB1表达定位的影响(×400倍) 红色荧光为HMGB1,蓝色荧光为细胞核

EP的神经保护作用机制仍不明确，本研究对EP的神经保护机制进行了进一步探讨。自噬是一把双刃剑，广泛存在于真核细胞中，它即是一种与凋亡、坏死并列的程序性细胞死亡方式，也是一种细胞清除细胞内异常聚集的蛋白及受损细胞器的自我保护方式。自噬过程中首先形成自噬囊泡，将需要降解的物质包裹在囊泡中再转运至溶酶体中降解，在囊泡形成过程中LC3由LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ转化，LC3 Ⅱ/Ⅰ比例可以反映自噬囊泡的形成情况。本研究在鱼藤酮诱导的细胞模型中观察到LC3 Ⅱ/Ⅰ的比例增高，而EP预处理则减少了Rot诱导的LC3 Ⅱ/Ⅰ的比例增高。有研究发现在PD模型中存在自噬受阻，LC3阳性自噬囊泡的数量显著增加[10]，自噬的激活可能是由神经毒素触发的程序性细胞死亡的一部分[11]，在帕金森病动物模型及患者中亦可观察到这种现象发生。本研究结果也提示EP可以抑制自噬的激活而起到保护作用。

HMGB1是一种非组蛋白的染色体结合蛋白，主要存在于细胞核中，参与DNA的重组、转录及修复[12]；在细胞外可作为一个信号分子，参与调解细胞分化及炎性介质的释放[13]；近年来的研究发现HMGB1可以从细胞核向胞浆转位，与自噬启动蛋白Beclin1相互作用，使得Beclin-Bcl-2复合体解聚而参与某些肿瘤细胞的自噬激活过程[14]。当HMGB1转移至细胞外时它通过与RAGE受体结合调节细胞自噬[15]。EP是HMGB1的转位抑制剂，本研究发现EP可以减少Rot诱导的HMGB1转位，本研究推测EP的神经保护作用可能与其减少HMGB1的转位有关。

综上所述，本研究表明EP可能通过抑制HMGB1的转位来减少多巴胺能神经元的自噬损伤而起到神经保护作用。EP作为一种无毒、稳定且可被人们食用的物质，研究其对多巴胺能神经细胞的保护作用及机制将为PD的治疗提供新的视点。

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Theprotectiveroleofethylpyruvateindopaminergicneuronaldamageinducedbyrotenone

XiongJing,HuDan,ZhangZhentao,etal.

DepartmentofNeurology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060

ObjectiveTo investigate the protective role of ethyl pyruvate in dopaminergic neuronal damage induced by rotenone.MethodsSH-SY5Y cells were treated with rotenone, and ethyl pyruvate with different concentration were pretreated to the cells. The cell viability was determined by MTT method. The apoptotic rate of SH-SY5Y cells were analyzed by flow cytometry after Annexin V/PI staining. The protein expression of LC3 Ⅱ/Ⅰ and P62 were assessed by Western blot. The expression and location of HMGB1 were analyzed by immnofluorescence staining.ResultsEthyl pyruvate decreased the apoptotic rate of SH-SY5Y cells induced by rotenone, and increased the cell viability. Ethyl pyruvate inhibited the activation of autophage induced by rotenone, accompanied by the increased expression level of P62. Otherwise, ethyl pyruvate also inhibited cytosolic translocation of HMGB1.ConclusionEthyl pyruvate could inhibit the activation of autophagy by reducing the cytosolic translocation of HMGB1 and plays a protective role in dopaminergic cell.

Ethyl pyruvate Parkinson’s disease Autophagy High mobility group box 1

R742.5

A

1007-0478(2017)06-0485-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.06.001

国家自然科学基金青年基金项目(项目编号81501107)

430060 武汉大学人民医院神经内一科[熊婧 胡丹 张振涛 张兆辉(通信作者)]

(2017-04-28收稿)