感宁颗粒的质量标准提高研究

严 佳，钟桂香，檀巧婷，宋洪涛，周 欣

感宁颗粒的质量标准提高研究

严 佳，钟桂香，檀巧婷，宋洪涛，周 欣*

目的提高感宁颗粒的质量标准。方法采用薄层色谱(TLC)法对感宁颗粒中连翘及黄芩进行定性鉴别并优化栀子的鉴别方法，用高效液相色谱法(HPLC)法同时测定黄芩苷、栀子苷、绿原酸的含量，色谱柱为Agilent Hypersil ODS (4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，进行梯度洗脱，柱温：25 ℃，检测波长为238 nm；流速：1.0 mL/min。结果TLC 法定性鉴别重复性好，阴性无干扰；黄芩苷、栀子苷、绿原酸分别在12～120 μg/mL (r=0.999 9)、9.6～96 μg/mL (r=0.999 7)、14.4～144 μg/mL (r=0.999 7)浓度范围内线性关系良好，平均回收率分别为99.32%、98.90%、99.14%。结论提高后的质量标准方法简便可行，专属性强，重复性好，能有效地控制感宁颗粒的质量。

感宁颗粒；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法；黄芩甘；栀子苷；绿原酸

0 引言

感宁颗粒为中国人民解放军第105医院非标准制剂[南NFB-(Z151)-2011]，处方由金银花、板蓝根、黄芩、连翘、栀子、玄参、知母、麦冬、地黄、龙胆、紫花地丁、石膏等12味中药组成。有疏风清热、解毒消肿的功效，用于热毒壅盛所致发热面赤、烦躁口渴、咽喉肿痛等症，主治外感风热型由表入里之感冒、上呼吸道感染、肺炎等热症，其疗效显著，安全性好。该制剂现行标准中对金银花、栀子进行鉴别；用紫外分光光度法对总黄酮进行了含量测定[1]。为进一步控制制剂质量，保证临床用药安全有效，笔者通过试验摸索，建立了黄芩苷、栀子苷、绿原酸的HPLC含量测定方法，增加了连翘、黄芩的TLC鉴别，并优化栀子的TLC鉴别条件，完善了该制剂的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦)、FA1004型电子天平(上海天平仪器厂)、KQ-800KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 绿原酸对照品(批号：110753-200413，中国食品药品检定研究院，含量96.2%)；连翘苷对照品(批号：110821-201213，中国食品药品检定研究院，含量98.9%)；栀子苷对照品(批号：110749-201316，中国食品药品检定研究院，含量97.5%)；黄芩苷对照品(批号：110715-201318，中国药品生物制品检定所，含量93.3%)；芦丁对照品(批号：100080-200707，中国食品药品检定研究院，含量92.5%)；金银花对照药材(批号：121060-201107，中国食品药品检定研究院)；连翘对照药材(批号：120908-201216，中国食品药品检定研究院)；栀子对照药材(批号：121054-201115，中国食品药品检定研究院)；黄芩对照药材(批号：120955-201309，中国食品药品检定研究院)；甲醇(色谱纯，上海科丰实业有限公司)；感宁颗粒(10 g/袋)(批号：150613、150625、150704，中国人民解放军第105医院)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱法

2.1.1 栀子[2-3]取本品30 g，研细，加70 ℃热水50 mL，加氯化钠0.5 g，超声处理20 min，使溶解，放冷，加入乙醚100 mL振摇提取，弃去上层乙醚液，收集下层水提取液，用水饱和的正丁醇振摇2次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用0.25%的氢氧化钠溶液洗涤2次，每次30 mL，弃去下层碱水层，再用正丁醇饱和的水20 mL洗涤，弃去下层水溶液，取上层正丁醇提取液吹干，残渣加甲醇1 mL 溶解，作为供试品溶液。另取栀子对照药材2 g，加水30 mL，70～80 ℃水浴回流1 h，加入乙醚30 mL振摇提取，其余操作同上述供试品溶液制备法，残渣加甲醇1 mL溶解，作为对照药材溶液。取栀子苷对照品，加甲醇制成1 mg/mL溶液，作为栀子苷对照品溶液。取缺栀子的感宁颗粒阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各15 μL，点于同一硅胶G板上，以二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸(12∶2.5∶2∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液在相同位置无干扰，见图1。

图1 栀子的TLC鉴别

2.1.2 连翘 取连翘苷对照品，加甲醇制成1 mg/mL 溶液，作为连翘苷对照品溶液。取连翘对照药材2 g，按“2.1.1”项下栀子对照药材溶液制备方法制成对照药材溶液。取缺连翘的感宁颗粒阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。取“2.1.1”项下供试品溶液及上述溶液各15 μL，照“2.1.1”项下方法试验，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液在相同位置无干扰，见图2。

图2 连翘的TLC鉴别

2.1.3 黄芩 取本品10 g，研细，加甲醇溶液20 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，用稀盐酸溶液调节pH值至1～2，用乙酸乙酯提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL，作为供试品溶液。另取黄芩对照药材1 g，加甲醇溶液20 mL，其余操作同黄芩供试品溶液制备方法，残渣加甲醇1 mL，作为对照药材溶液。取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺黄芩的感宁颗粒阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-醋酸-水(10∶7∶5∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1 %三氯化铁乙醇溶液[4]。供试品色谱中，在与对照品色谱及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液在相同位置无干扰，见图3。

图3 黄芩的TLC鉴别

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件[4-9]色谱柱Agilent Hypersil ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B，按表1进行梯度洗脱，检测波长为238 nm；流速：1.0 mL/min；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2.2 溶液的制备 ①对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品6 mg、栀子苷对照品4 mg、绿原酸对照品5 mg至100 mL容量瓶中，加50%甲醇，溶解完全后稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液。②供试品溶液的制备：精密称取本品1.0 g，置100 mL的容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，放置，滤过，取续滤液，即得。③阴性对照溶液的制备：按处方量，分别称取除黄芩、栀子、金银花外的其余药材制成的阴性颗粒1.0 g，按“2.2.2”项供试品溶液的制备方法同法处理，即得。

2.2.3 方法学考察 专属性试验：分别精密吸取供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。结果见图4，在阴性对照溶液色谱图上黄芩苷、栀子苷、绿原酸出峰相应位置未见色谱峰，表明本方法专属性良好。

线性关系考察：精密称取黄芩苷对照品 15.0 mg、栀子苷10.0 mg、绿原酸12.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，超声使其完全溶解，得到混合对照品储备溶液。分别精密吸取混合对照品储备溶液1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0、10.0 mL至25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，经过滤，分别精密吸取各浓度对照品溶液续滤液10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。以峰面积对对照品浓度进行线性回归，得标准曲线。黄芩苷Y=29.194 X-4.756 (r=0.999 9)，栀子苷Y=3.382 X+0.378 (r=0.999 7)，绿原酸Y=3.887 X-0.035 (r=0.999 7)。结果表明，黄芩苷、栀子苷、绿原酸分别在12～120、9.6～96、14.4～144 μg/mL内具有良好的线性关系。

精密度试验：精密吸取同一份混合对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算黄芩苷、栀子苷、绿原酸的RSD分别为0.28%、0.52%、0.67%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h时，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，结果黄芩苷、栀子苷、绿原酸RSD分别为0.13%、0.89%、0.92%，表明供试品在10 h内稳定性良好。

重复性试验：精密称取同一批感宁颗粒(批号：140613)，分别制备6份供试品溶液，结果黄芩苷、栀子苷、绿原酸的RSD分别为0.46%、0.95%、1.02%，表明该方法重复性良好。

加样回收试验(表2)：分别精密称取已知含量的同一批感宁颗粒(黄芩苷2.10 mg/g，栀子苷0.44 mg/g，绿原酸0.74 mg/g，批号：150613)6份，每份约1.0 g，分别加入黄芩苷对照品溶液3.5 mL (0.605 7 mg/mL)、栀子苷1.1 mL (0.414 2 mg/mL)、绿原酸1.5 mL (0.508 8 mg/mL)，按“2.2.2”项下“供试品溶液的制备”同法操作，根据“2.2.1”项下色谱条件进行测定，计算平均回收率。

图4 感宁颗粒的HPLC图

成分取样量(g)样品量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)黄芩苷100202183221200428359907986217810009212472120041906974510019214782120042001968110002209952120042413101031003022004212004259897141001121211212004246210024栀子苷1002004534045560898597709780096100090449604556089659809100190455504556089629673100020460104556090129682100300478504556093049919100110452004556089989829绿原酸100200770607632151029691982719310009078140763215487100541001907712076321541210089100020761507632150089687100300769807632151219726100110790907632153259717

2.2.4 样品含量测定 分别从3批感宁颗粒中精密称取颗粒约1.0 g，每批3份，按“2.2.2”项下同法操作，制备供试品溶液，测定并计算黄芩苷含量。结果批号为150613、150625、150704的3批样品中黄芩苷的含量分别为2.10、2.18、2.16 mg/g；栀子苷的含量分别为0.44、0.46、0.47 mg/g；绿原酸的含量分别为0.74、0.78、0.77 mg/g。

3 讨论

3.1 测定波长的选择 取混合对照品溶液，在200～400 nm范围内进行扫描，结果黄芩苷在276 nm 处有最大吸收波长，栀子苷在238 nm处有最大吸收波长，绿原酸在326 nm处有最大吸收波长。考虑到样品中栀子苷的含量较低，为使栀子苷检测灵敏度较高，且在238 nm波长处3个成分均有较好的紫外吸收，故选择栀子苷的最大吸收波长238 nm为本试验检测波长。

3.2 薄层色谱鉴别 现行标准金银花中绿原酸的薄层色谱鉴别方法，试验结果明显，可重现，且未用毒性较大的有机溶剂，故本试验对原标准未做改动。现行标准中没有建立连翘的薄层色谱鉴别方法，笔者经多次试验及参考药典成方制剂中连翘的鉴别，选择连翘中的指标性成分连翘苷进行鉴别。

现行标准中栀子的薄层色谱鉴别方法，需要使用大孔吸附树脂柱进行纯化，操作复杂。在进行连翘鉴别时，发现栀子鉴别可与其使用同样的供试品处理方法和展开条件，且不需进行过柱纯化，操作相对简单，故本标准研究优化了栀子的鉴别方法。

黄芩的TLC鉴别试验中，曾参考文献[10]，使用聚酰胺薄膜板，但阴性始终有干扰。本试验参考八宝坤顺丸[4]中黄芩鉴别项下供试品的处理方法，对参考文献中展开剂的比例进行微调，采用硅胶G薄层板，供试品中黄芩苷斑点明显，阴性无干扰，说明该方法可行。

3.3 含量测定方法 现行标准中含量测定项下对总黄酮用紫外分光光度法进行测定，无指标性成分的含量测定。本方中石膏为君药，石膏中的主要成分为含水硫酸钙(CaSO4·2H2O)，其含量测定采用滴定法，而本品为中药制剂，其背景颜色会干扰滴定终点的判断。因此，本试验采用HPLC法同时测定黄芩甘、栀子苷、绿原酸3种成分的含量。

4 结论

本试验所建立的连翘、栀子、黄芩的TLC鉴别，分离效果好，专属性强，阴性无干扰；黄芩苷的HPLC法含量测定，灵敏准确，简便快捷，重现性好。上述定性和定量方法的结合，有助于更科学、更全面地进行感宁颗粒的质量评价，确保临床用药的安全、有效。

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[2] 张秋玲,黄志豪,伍柏坚,等.消炎解毒丸质量标准研究[J].广东药学院学报,2014,30(5):599-603.

[3] 张永峰,姬雪礼,张泽,等.止咳化痰片质量标准研究[J].食品与药品,2014,15(4):269-272.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:461,968,1552.

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StudyonqualitystandardimprovementofGanninggranules

YAN Jia,ZHONG Gui-xiang,TAN Qiao-ting,SONG Hong-tao,ZHOU Xin*

(Department of Pharmacy,Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region,Fuzhou 350025,China)

ObjectiveTo improve the quality standard for Ganning particles.MethodsForsythia suspensa and Scutellaria baicalensis and Georgi were identified by TLC.HPLC was used to determine the contents of Baicalin,Geniposide and Chlorogenic acid.The method employed a column of Agilent Hypersil ODS (4.6 mm×250 mm,5 μm) with the mobile phase of acetonitrile (A)-0.1% hydrochloric acid (B) at a temperature of 25 ℃.The detection wavelength was set at 238 nm;the flow rate was 1.0 mL/min.ResultsThe TLC statutory identification was repeatable and negative without interference.The calibration curve showed a good linear relationship within the range of 12～120 μg/mL for Baicalin (r=0.999 9),9.6～96 μg/mL for Geniposide (r=0.999 7) and 14.4～144 μg/mL for Chlorogenic acid (r=0.999 7),the average recovery was 99.32%,98.90% and 99.14%.ConclusionThe improved quality standard is simple,specific and reproducible,and can effectively control the quality of Ganning granules.

Ganning granules;Quality standard;TLC;HPLC;Baicalin;Geniposide;Chlorogenic acid

2017-05-25

南京军区福州总医院药学科，福州 350025

军队医疗机构制剂标准提高科研专项重点课题(14Z-JZ17)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201712016