麦角甾醇对LPS诱导的肺损伤小鼠的抗炎作用研究

葛金林，曾余丰，钱俊敏，金晨慈

麦角甾醇对LPS诱导的肺损伤小鼠的抗炎作用研究

葛金林1*，曾余丰1，钱俊敏2，金晨慈1

目的研究麦角甾醇对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的抗炎作用研究。方法取50只雄性BABL/c小鼠随机分为5组：空白对照组、模型组、地塞米松组(2 mg/kg)、麦角甾醇低剂量组(20 mg/kg)、麦角甾醇高剂量组(40 mg/kg)。空白对照组和模型组按体积给予生理盐水，地塞米松组(2 mg/kg)、麦角甾醇组(20、40 mg/kg)灌胃给予相应药物。给药1 h后，除空白对照组，其余各组小鼠气管滴注20 μg LPS。检测小鼠肺干湿重比(W/D)，肺泡灌洗液(BALF)中超氧化物歧化酶(SOD)水平、丙二醛(MDA)含量，血清与肺泡灌洗液炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平。取各组小鼠肺组织做HE染色，并检测肺组织Rho、ROCK1、ROCK2、p-NF-κBP65、NF-κBP65、p-IκBα、IκBα蛋白表达。结果麦角甾醇20、40 mg/kg能显著提升LPS诱导的急性肺损伤小鼠血清SOD水平，降低MDA含量；改善血清及肺泡灌洗液炎症因子水平和肺组织病理学改变；降低肺组织Rho、ROCK1、ROCK2、p-NF-κBP65、p-IκBα蛋白表达。结论麦角甾醇对LPS诱导的急性肺损伤小鼠有保护作用，其作用可能与Rho/ROCK/NF-κB信号通路有关。

麦角甾醇；肺损伤；Rho/ROCK/NF-κB

0 引言

急性肺损伤是指各种直接和间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全[1]。急性肺损伤的病理生理特征是肺容积减少、肺顺应性降低、通气/血流比例失调等[2]。急性肺损伤在临床上是较为常见的急危重症之一，主要病理生理学改变是炎症反应。如果控制不当，急性肺损伤可能发展成为急性呼吸窘迫综合征，引起多器官脏器功能衰竭[3]。因此，寻找治疗急性肺损伤的药物并研究其作用机制，改善患者的生存质量，已经成为当前的研究热点。

麦角甾醇又称为麦角固醇，是一种甾体类化合物。麦角甾醇是微生物细胞膜的重要组成部分，对确保细胞膜的完整性、膜结合酶的活性、膜的流动性、细胞活力及细胞物质运输等起重要作用[4]。本研究拟观察麦角甾醇对急性肺损伤小鼠的保护作用。

Rho蛋白是小G蛋白超家族的亚家族成员，目前已经发现20多种Rho家族成员。根据序列的同源程度和功能可分为RhoA、Racl、Cdc42及缺乏GTP酶活性等4类[5]。Rho的下游靶蛋白是ROCK，又称Rho激酶。Rho激酶是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，又称为Rho相关激酶，在缺血、炎症、外伤等多种病理因素中起重要作用[6]。其参与细胞黏附、迁移和细胞骨架重构、调剂中性粒细胞产生的活性氧等。研究表明，RhoA在炎症应答过程中起重要作用[7]。转录因子NF-κB的主要形式为p50、p65和IκBα。研究表明，NF-κB可以激活、调节、转录下游炎症因子表达。本研究探讨了麦角甾醇对急性肺损伤的作用机制是否通过Rho/ROCK/NF-κB信号通路起作用。

1 材料与试剂

1.1 材料与试剂 麦角甾醇 (纯度：97%)购自中国食品药品检定研究院。地塞米松(Dex)购自南京先声药业。脂多糖(LPS，大肠杆菌血清型0111∶B4，No.L-2630，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)、IL-1β、IL-6和TNF-α酶联免疫试剂盒由南京凯基生物科技有限责任公司提供。MDA、SOD试剂盒由南京建成生物试剂有限公司提供。Rho、ROCK1、ROCK2、p-IκBα、IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65抗体均由Cell Signaling Technology (Danvers，USA)公司提供。

1.2 动物 50只BALB/c小鼠(体重：20～22 g)由扬州大学比较医学中心提供。所有动物于室温(22±1)℃，空气湿度40%～50%，昼夜交替时间12 h条件下普通饲料喂养，自由饮水。

2 方法

2.1 分组及给药 取50只雄性BABL/c小鼠随机分为5组：空白对照组、模型组、地塞米松组(2 mg/kg)、麦角甾醇低剂量组(20 mg/kg)、麦角甾醇高剂量组(40 mg/kg)。空白对照组和模型组按体积给予生理盐水，地塞米松组(2 mg/kg)、麦角甾醇组(20、40 mg/kg)灌胃给予相应药物。给药1 h后，除空白对照组，其余各组小鼠气管滴注20 μg LPS(溶于50 μL PBS)，空白对照组气管内滴注50 μL PBS。

2.2 肺泡灌洗液收集 给药6 h后处死小鼠，抽取500 μL预冷的PBS (pH 7.2)，用注射器缓慢注入左肺并灌洗，回抽得到肺泡灌洗液(BALF)。抽取3次后，将肺泡灌洗液以1 500 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液冻存于-80 ℃备用。

2.3 肺干湿重比测定 将右侧肺组织取出，分离食管和气管，测量湿重；将其置于60 ℃烘箱内48 h至恒重，测量干重，计算肺干湿重比值(干重/湿重×100%)。

2.4 组织病理学检查 小鼠眼眶取血后处死，将肺组织固定于4%的中性福尔马林溶液中过夜。将组织固定包埋于石蜡中，切成4 mm厚的切片。去石蜡，用苏木素-伊红染液染色(HE染色)，采用光学显微镜观察肺损伤和肺部炎症细胞的浸润情况。

2.5 肺泡灌洗液中SOD、MDA含量测定 按照试剂盒说明书测定LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺泡灌洗液中SOD、MDA的含量。

2.6 血清与肺泡灌洗液中炎症因子的测定 小鼠眼眶取血，4 500 r/min离心15 min后取上清液冻存于-80 ℃备用。按照ELISA试剂盒说明书检测LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

2.7 Western blot分析 将肺组织剪碎，用RIPA裂解液进行提取总蛋白，12 000 r/min条件下离心15 min，收集上清后采用BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白样品置于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中直至样品到达分离胶的底部，并将其转移到PVDF膜上。转膜完毕后，将条带浸入5%脱脂牛奶中封闭2 h。封闭结束后将PVDF膜浸入一抗中于4 ℃孵育过夜。第2天弃一抗，用TBST洗4次后，加入第2抗体于摇床室温孵育2 h。二抗孵育结束后，弃抗体，取出PVDF膜用TBST清洗4次。使用凝胶成像系统进行曝光并用凝胶扫描成像系统扫描条带分析各条带灰度值。

3 结果

3.1 麦角甾醇对急性肺损伤小鼠肺组织干湿重比的影响 如图1所示，与空白对照组比较，模型组小鼠在给予LPS造模之后，肺干湿重比显著增加。与模型组相比，麦角甾醇组肺干湿重比值降低。

3.2 麦角甾醇对急性肺损伤小鼠肺泡灌洗液中MDA、SOD的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠注射LPS后，MDA含量增加，SOD活力降低。与模型组比较，麦角甾醇可以显著降低MDA含量，提升SOD 活力。见图2。

图1 各组小鼠肺组织干湿重比比较

注：C.空白组，M.模型组，D.地塞米松2 mg/kg组，EL.麦角甾醇20 mg/kg组，EH.麦角甾醇40 mg/kg组*与M组比较，P<0.01；#与C组比较，P<0.01

图2 各组小鼠肺泡灌洗液中MDA、SOD比较

注：C.空白组，M.模型组，D.地塞米松2 mg/kg组，EL.麦角甾醇20 mg/kg组，EH.麦角甾醇40 mg/kg组*与M组比较，P<0.01；#与C组比较，P<0.01

3.3 麦角甾醇对急性肺损伤小鼠肺组织病理的影响 如图3所示，与空白对照组相比，模型组小鼠在注射LPS之后，肺组织可见明显的炎性细胞浸润。与模型组相比，麦角甾醇可以显著减少炎性细胞浸润，表现出对LPS诱导的肺损伤小鼠的保护作用。

3.4 麦角甾醇对急性肺损伤小鼠血清与肺泡灌洗液中炎性细胞因子表达的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠在注射LPS后，血清与肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子含量显著增加。与模型组比较，麦角甾醇降低血清与肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，改善LPS诱导的急性肺损伤小鼠炎性细胞因子的表达。见图4。

3.5 麦角甾醇对急性肺损伤小鼠Rho/ROCK/NF-κB信号通路表达的影响 采用Western blot检测麦角甾醇对急性肺损伤小鼠相关蛋白表达的影响，以确定其相关作用机制。与空白对照组相比，模型组小鼠在给予LPS后，p-NF-κB、p-IκBα、Rho、ROCK1 ROCK2的表达上调，麦角甾醇治疗后，以上蛋白的表达显著下调。结果表明，麦角甾醇可能通过Rho/ROCK/NF-κB信号通路改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤。见图5。

图3 麦角甾醇对急性肺损伤小鼠肺组织病理的影响(200×)

图4 麦角甾醇对急性肺损伤小鼠血清与肺泡灌洗液中炎性细胞因子表达的影响

图5 麦角甾醇对急性肺损伤小鼠Rho/ROCK/NF-κB信号通路表达的影响

4 讨论

急性肺损伤是急性呼吸窘迫综合征的早期阶段，其病理特征为肺弥漫性损害、肺泡毛细血管通透性增加、肺泡内水肿等[8-9]。

炎性细胞因子释放引发的肺组织炎症反应是导致急性肺损伤患者肺泡中毛细血管通透性增加的主要原因。中性粒细胞在其中发挥重要作用[10]。中性粒细胞是炎症反应过程中的主要细胞，激活后可以释放IL-1β、IL-6、TNF-α，破坏毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞间的紧密连接，导致肺泡毛细血管通透性增加[11]。TNF-α由单核细胞产生，具有免疫调节和炎症调控功能。IL-1β是一种促炎细胞因子，参与组织水肿。IL-6具有免疫调节功能，可以增强免疫反应[12]。本研究中，与空白对照组比较，模型组小鼠在给予LPS后，血清与肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高。与模型组相比，麦角甾醇可以显著降低以上炎症因子的表达，表明麦角甾醇对LPS诱导的急性肺损伤小鼠有明显的改善作用。

NF-κB是一种重要的转录因子，在调控IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的过程中发挥重要作用[13]。在静息状态下，NF-κB与NF-κB肺抑制性蛋白(IκB)结合成为非活性状态，存在于胞浆中。在LPS的刺激下，NF-κB从细胞质转入细胞核，从而启动炎性细胞因子的转录[14-15]。ROCK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由ROCKⅠ和 ROCKⅡ 2种异构体组成，是Rho下游的靶效应分子，与炎症关系密切。Western blot 结果表明，麦角甾醇可以缓解LPS诱导的急性肺损伤，其机制可能与Rho/ROCK/NF-κB信号通路相关。

综上所述，麦角甾醇可以缓解LPS诱导的急性肺损伤，其机制可能与Rho/ROCK/NF-κB信号通路有关。

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Anti-inflammatoryeffectsofergosterolonLPS-inducedlunginjuryinmice

GE Jin-lin1*,ZENG Yu-feng1,QIAN Jun-min2,JIN Chen-ci1

(1.Department of Respiratory Medicine,Wenzhou Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital,Wenzhou 325000,China;2.Department of Respiratory Medicine,Yongjia People′s Hospital,Wenzhou 325100,China)

ObjectiveTo investigate the anti-inflammatory effect of ergosterin on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI).MethodsTotally 50 BABL/c mice were divided into 5 groups randomly:control group,model group,dexamethasone group (2 mg/kg),ergosterin (20 mg/kg),ergosterin (40 mg/kg).The mice were given ergosterin or dexamethasone at 1 h before intratracheal instillation of LPS.The lung wet-to-dry weight (W/D) ratio,the level of super oxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF),and the levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α),interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) in BALF were detected.The protein expression of Rho,ROCK1,ROCK2,p-NF-κBP65,NF-κBP65,p-IκBα and IκBα in lung tissue was analyzed.ResultsErgosterin of 20 mg/kg and 40 mg/kg could increase the level of SOD and decrease the content of MDA,and improve the levels of pro-inflammatory cytokines in serum and BALF and pathological changes.It could also decrease the protein expression of Rho,ROCK1,ROCK2,p-NF-κBP65 and p-IκBα in lung tissue.ConclusionErgosterin can ameliorate the LPS-induced acute lung injury in mice and its related mechanism might be related to inhibition of Rho/ROCK/NF-κB pathway.

Ergosterin;Lung injury;Rho/ROCK/NF-κB

2017-07-20

1.温州市中西医结合医院呼吸内科，浙江 温州 325000；2.永嘉县人民医院呼吸内科，浙江 温州 325100

浙江省中医药科研基金项目(2015ZB111)

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201712003