联合检测SALL4 、OCT3/4、CD117 和glypican-3在恶性生殖细胞肿瘤诊断及分型中的应用

郭韦韦， 敖启林，彭晓蓉，董华

（1湖北省公安县人民医院病理科，公安434300；2华中科技大学同济医学院附属同济医院病理学研究所，武汉430030）

联合检测SALL4 、OCT3/4、CD117 和glypican-3在恶性生殖细胞肿瘤诊断及分型中的应用

郭韦韦1， 敖启林2*，彭晓蓉1，董华1

（1湖北省公安县人民医院病理科，公安434300；2华中科技大学同济医学院附属同济医院病理学研究所，武汉430030）

目的探讨联合检测SALL4 、OCT3/4、CD117和glypican-3在恶性生殖细胞肿瘤（malignant germ cell tumors，MGCTs）诊断和分型中的应用价值。方法采用免疫组织化学Envision法检测117例MGCTs中SALL4 、OCT3/4、CD117和Glypican-3的表达情况，包括25例精原细胞瘤、12例无性细胞瘤、20例生殖细胞瘤、18例胚胎性癌、42例卵黄囊瘤，另选取24例非生殖细胞恶性肿瘤作为对照，包括8例卵巢透明细胞癌，6例卵巢浆液性癌，5例胸腺癌，5例淋巴瘤。结果SALL4在全部MGCTs中均呈细胞核弥漫强阳性表达；OCT3/4在精原细胞瘤(24/25)、无性细胞瘤(11/12)、生殖细胞瘤(19/20)以及全部胚胎性癌(18/18)中呈细胞核阳性表达，在卵黄囊瘤均阴性；CD117在精原细胞瘤(23/25)、无性细胞瘤(11/12)、生殖细胞瘤（18/20）以及部分卵黄囊瘤（26/42）中呈不同程度的细胞膜阳性表达，仅在少数（2/18）胚胎性癌呈灶性表达；glypican-3在卵黄囊瘤（37/42）中瘤细胞的细胞质表达，另在(3/18)例胚胎性癌、(1/12)例无性细胞瘤呈灶性表达。24例对照中，SALL4 、OCT3/4均为阴性，CD117在1例卵巢浆液性癌和1例胸腺癌中呈灶性表达，glypican-3在1例卵巢透明细胞癌中呈灶性表达，其余肿瘤CD117、glypican-3均阴性。结论SALL4可作为MGCTs病理诊断的通用免疫标记物，OCT3/4和CD117有助于精原细胞瘤、无性细胞瘤、生殖细胞瘤以及胚胎性癌的诊断和鉴别诊断，glypican-3和CD117阳性有助于卵黄囊瘤的诊断。联合检测这4个抗体在MGCTs的病理诊断和分型中有很高的临床应用价值，可作为一线抗体组合推广运用。

生殖细胞肿瘤；SALL4；OCT3/4；CD117；Glypican-3；病理诊断；免疫组织化学

恶性生殖细胞肿瘤（malignant germ cell tumors MGCTs）是一组共同起源于胚胎性腺的原始生殖细胞肿瘤，组织学类型复杂多样。不同组织类型，其生物学行为、治疗方式和预后有所不同。在临床外检工作中，我们较常见的精原细胞瘤（无性细胞瘤、生殖细胞瘤）、胚胎性癌、卵黄囊瘤以及一些非生殖细胞源性肿瘤的镜下形态结构常相互交叉或重叠，单纯依靠HE染色，诊断难度大。目前，用于MGCTs病理诊断和分型的免疫组化抗体很多，如PLAP、AE1/AE3、EMA、CD30、HCG、AFP等，这些抗体虽多重组合，但特异性和敏感性仍不甚满意，既增加了患者的经济负担，又不利于MGCTs患者的治疗与预后判断。

SALL4是近几年来研究较热门的一种锌指蛋白转录因子，对维持胚胎干细胞的多向潜能性和自我更新起着重要作用。多数学者报道，SALL4在MGCTs中具有高度敏感性和特异性[1-6]。Glypican-3在卵黄囊瘤中表达较为敏感，相比于AFP，其在诊断上可能更有优势[4,5]。而OCT3/4和CD117作为诊断MGCTs的两种常见抗体，具有很好的临床应用基础。为进一步探讨这4个抗体联合应用在MGCTs诊断与分型中的临床应用价值，本文检测了睾丸、卵巢以及中枢神经系统、纵膈、腹膜后、骶尾部的共 117例 MGCTs中 SALL4 、OCT3/4、CD117和glypican-3的表达情况。

材料与方法

1 材料

收集华中科技大学同济医学院附属同济医院病理学研究所2012年至2016年间保存的117例原发纯性MGCTs，其中，经典精原细胞瘤25例（患者年龄13-60岁，发生于睾丸20例，其中3例发生于隐睾，前纵膈4例，腹膜后1例）；无性细胞瘤12例（患者年龄14-34岁；其中左卵巢6例，右卵巢5例，双侧卵巢同时发生1例）；生殖细胞瘤20例（患者年龄8-70岁，位于鞍区10例，松果体6例，其他部位4例）；胚胎性癌18例（年龄17-42岁，男性；16例发生在睾丸，2例发生在前纵膈）；卵黄囊瘤42例（男性17例，年龄1-22岁；女性25例，年龄16-55岁；发生于睾丸9例，卵巢16例，前纵膈6例，骶尾5例，其他6例）。

另选在组织学上易与MGCTs混淆的24例非生殖细胞恶性肿瘤作为对照。包括8例卵巢透明细胞癌， 6例卵巢高级别浆液性癌，5例胸腺癌，5例弥漫大B细胞淋巴瘤。

以上全部病例均经过2名富有经验的高年资医生复核。

2 方法

全部标本均经过10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4µm切片，HE染色，光镜观察后，选取典型病变，4µm切片，应用Envision法进行免疫组织化学染色，全部免疫组织化学染色均在半自动Bio Gene染色仪上完成。

3 免疫组织化学染色

SALL4（克隆号sc-101147；Santa Cruz公司）、OCT3/4、CD117、glypican-3（均购自福州迈新生物技术开发公司）。以PBS代替一抗作为阴性对照，并分别设置阳性对照。切片常规脱蜡至水后，蒸馏水洗，EDTA（PH=9.0）液中高压修复2.5min，PBS水洗；3% H2O2室温下孵育10min，滴加一抗常温孵育1h，PBS水洗；滴加生物素化抗兔二抗，常温孵育30min，PBS水洗；DAB显色10min，苏木素复染3min。结果判定：以整张切片内着色阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的比例为主要观察因素，结合着色强弱（淡黄色、黄色、棕黄色或棕色）综合判断。计数10个高倍视野（×400倍）分析阳性细胞百分数，以＜10%为（-），10%～30%为(+)，31%～60%为(++)，＞60% (+++)。结果判定由2名经验丰富的病理医师运用双盲法进行评估。

4 统计分析

采用SPSS13.0软件进行统计学处理，组间阳性率比较采用Fisher确切概率法，以P＜0.05具有统计学意义。

结 果

1 SALL4在各类型肿瘤中的表达

SALL4在各组MGCTs中均呈弥漫性细胞核强阳性表达，相对敏感度均为100% （表1，表3，图1B，图2B，图3B）。SALL4在全部24例对照病例中均为阴性， SALL4在MGCTs中的相对敏感性与对照组相比较，差异显著（表3）。

2 OCT3/4、CD117和glypican-3在各类型肿瘤中的表达

OCT3/4在多数精原细胞瘤（18/25，72%）、无性细胞瘤（9/12，75%）、生殖细胞瘤(17/20，85%)以及胚胎性癌（15/18，83.3%）中呈弥漫性细胞核表达（表1），其中在精原细胞瘤、无性细胞瘤、生殖细胞瘤以及胚胎性癌中相对敏感性分别为（24/25，96%）、（11/12，91.7%）、（19/20，95%） 和（18/18，100%），但在全部42例卵黄囊瘤及24例对照病例中均不表达（表1和表2）。OCT3/4在前面四种肿瘤中的相对敏感性与卵黄囊瘤及对照组比较，差异显著（表3）。

CD117在精原细胞瘤（23/25，92%）、无性细胞瘤(11/12，91.7 %)、生殖细胞瘤（18/20，90%）以及部分卵黄囊瘤（26/42，61.9%）中呈不同程度的细胞膜阳性表达（表1，表3，图3C）。另在少数（2/18）胚胎性癌、1例卵巢浆液性癌和1例胸腺癌中呈灶性阳性表达，其余肿瘤均为阴性（表1和表2）。与胚胎性癌及对照组比较，CD117分别在前面四种MGCTs相对敏感性高，表达较好，差异显著。

Glypican-3阳性表达定位在细胞质，在多数卵黄囊瘤中以弥漫（28/42，66.7%）或中等强度（7/42，16.7%）形式进行表达（表1和图3D），在卵黄囊瘤相对敏感性为（37/42，88.1%）（表3）。另外，glypican-3在3例胚胎性癌、1例无性细胞瘤以及1例卵巢透明细胞癌中呈灶性表达，其余肿瘤均阴性（表1和表2）。与其他类型MGCTs及对照组比较，Glypican-3在卵黄囊瘤敏感性强，差异显著。

表1 SALL4、OCT3/4、CD117、Glypican-3在MCCTs中的表达 [n(%)]Tab.1 Expression of SALL4, OCT3/4, CD117 and glypican-3 in different MGCTs [n(%)]

表2 SALL4、OCT3/4、CD117和glypican-3在非生殖细胞肿瘤中的表达 (n)Tab. 2 Expression of SALL4, OCT3/4, CD117 and glypican-3 in malignant nongerm cell tumors (n)

表3 SALL4、OCT3/4、CD117和glypican-3在MCCTs中的相对敏感度 [n(%)]Tab. 3 Positive rate of SALL4, OCT3/4, CD117, and Glypican-3 in different MGCTs [n(%)]

图 1 SALL4在睾丸精原细胞瘤中的表达。A，HE染色；B，SALL4的免疫组化染色显示瘤细胞呈弥漫强阳性表达；比例尺，200μmFig. 1 Expression of SALL4 in testicular seminoma. A, HE staining; B, immunohistochemical staining showed positive and diffusive SALL4 in tumor cells; scale bar, 200μm

图 2 SALL4在胚胎性癌中的表达。A，HE染色；B，SALL4的免疫组织化学染色显示瘤细胞呈弥漫强阳性表达；比例尺，200μmFig. 2. Expression of SALL4 in embryonal carcinoma. A, HE staining; B, immunohistochemical staining showed positive and diffusive SALL4 in the tumor cells; scale bar, 200μm

图3 SALL4、CD117和glypican-3在卵黄囊中的表达。A，HE染色；B，SALL4免疫组织化学染色；C，CD117免疫组织化学染色；D，glypican-3免疫组织化学染色；比例尺，200μmFig. 3 Expression of SALL4, CD117 and glypican-3 in the yolk sac. A, HE staining; B to D, immunohistochemical staining of Sall4 (B), CD117 (C) and glypican-3 (D); scale bar, 200μm

讨 论

SALL4是近几年来新发现的原癌基因，定位于人类染色体 20q13.13-13.2，是人类婆罗双树样基因SALL家族成员之一。多数学者报道了SALL4在生殖细胞肿瘤中具有高度敏感性和特异性。曹登峰等[1-3]分别检测了来自睾丸、卵巢以及性腺外的原发和转移性的生殖细胞肿瘤中的SALL4表达情况，报道显示SALL4在精原细胞瘤、无性细胞瘤、卵黄囊瘤及胚胎性癌中均呈弥漫强阳性表达（约90%的肿瘤细胞着色），阳性率均为100%，而在对照的非生殖源性肿瘤中只有极少数样本检测到SALL4呈灶性弱阳性表达。该实验室前期关于SALL4在生殖细胞肿瘤中的研究中[6]，也报道了SALL4在来自性腺和性腺外的不同类型生殖细胞肿瘤中均具有较好的表达。在非生殖细胞肿瘤中，SALL4也可在小部分分化差的癌（卵巢浆液性癌、胃肠腺癌、子宫内膜样癌等），以及呈胚胎样分化的肿瘤（Wilms瘤、恶性横纹肌样瘤）中出现表达[7,8]。文中结果显示SALL4在所检测的来自睾丸、卵巢以及中枢神经系统、纵膈、腹膜后及骶尾部的全部生殖细胞肿瘤均呈弥漫阳性表达，敏感性为100%，进一步验证了前面观点的准确性。而在所选的组织学上易与MGCTs混淆的非生殖细胞肿瘤对照组均为阴性，分析可能与选择样本数小及肿瘤类型有关。总之，SALL4在诊断MGCTs上是一个非常好用的通用免疫标记物。

OCT3/4和CD117已被证实在生殖细胞肿瘤的诊断和分型中有较高临床应用价值。OCT3/4在精原细胞瘤、无性细胞瘤、生殖细胞瘤以及胚胎性癌中敏感性高，在卵黄囊瘤中几乎不表达，而CD117在前面三种肿瘤中表达较好，在胚胎性癌中表达差[9]。本文结果显示OCT3/4在前述四类肿瘤中多数肿瘤中呈弥漫性表达，在全部卵黄囊瘤均不表达，而CD117在前面三种MGCTs中表达较好，在胚胎性癌中表达不理想，再次证实了前面观点。结果还显示CD117在部分卵黄囊瘤样本中表达较好。提示在诊断MGCTs时，如遇到卵黄囊瘤的其他免疫标记物阴性，CD117阳性，不能完全排除卵黄囊瘤成分存在的可能性，需结合形态学综合判定，因为卵黄囊瘤常和其他生殖肿瘤伴发，以免漏诊。

OCT3/4作为干细胞标记物，与部分体细胞恶性肿瘤的发生发展相关[10]。但Looijenga等利用组织芯片技术检测了100余种肿瘤类型3600个标本中 OCT4表达情况， 结果发现在非生殖细胞肿瘤中 OCT4几乎不表达[11]。文中结果显示，OCT3/4在24例非生殖细胞肿瘤均呈阴性，提示OCT3/4在MGCTs与非生殖源性肿瘤鉴别上可能发挥作用，需要更深入研究和大样本的支持。CD117除标记胃肠间质瘤外，在其他如卵巢浆液性癌、胸腺癌等很多肿瘤中都可表达。文中结果显示了CD117在一例浆液性癌和一例胸腺癌中呈局灶表达，提示CD117在生殖细胞肿瘤诊断与鉴别诊断上，常需和其他抗体联合运用。

Glypican-3，即膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白，也是新近发现的一种癌胚抗原。Glypican-3在妊娠期主要由胎肝合成，在出生后的正常组织中几乎无表达。研究表明glypican-3联合其他肝癌标记物如HepPar1、AFP等在肝细胞癌的诊断、预后监测中发挥重要作用。特别是glypican-3在低分化肝细胞癌中表达更敏感[12]。同时，陆续有学者报道了glypican-3在卵黄囊瘤中表达情况。曹登峰等[1,2]检测29例睾丸卵黄囊肿瘤样本中均出现glypican-3染色，但有45%的样本出现＜30%肿瘤细胞数的局灶染色，而在26例卵巢卵黄囊肿瘤中，glypican-3的表达率为69%。张春芳等[4]检测14例睾丸卵黄囊瘤中的glypican-3，敏感性高达92.9%，大部分病例呈现弥漫强阳性。Trinh等[5]报道31例卵巢卵黄囊瘤中glypican-3表达阳性率为79.3%。我们的结果与张春芳、Trinh等报道的结果更为接近： glypican-3在卵黄囊瘤中敏感性达88.1%，在多数样本中呈现弥漫强阳性表达。AFP在卵黄囊瘤中常呈局灶或片状着色[1,2]。因此，我们认为，相比AFP，glypican-3在卵黄囊瘤的诊断上更有优势，是又一个敏感性和相对特异性均较好的标记物。

综上所述，在诊断和鉴别诊断MGCTs中，联合检测文中四个指标时，当SALL4阳性时，考虑生殖细胞源性肿瘤可能；OCT3/4和CD117阳性支持精原细胞瘤或（无性细胞瘤或生殖细胞瘤）诊断，OCT3/4阴性、CD117阳性和glypican-3阳性支持卵黄囊瘤诊断。此外，生殖细胞肿瘤常以两种或多种成分的混合性形式发生。含多种恶性成分的混合性生殖细胞肿瘤预后可能相对更差[13]。如遇文中所选四个抗体均阳性，要考虑到混合性生殖细胞肿瘤的可能性。鉴于抗体的敏感性和特异性，在MGCTs外检中，需多种抗体联合运用确保病理结果准确性，以便临床采取规范化治疗。联合检测SALL4、OCT3/4、CD117和glypican-3在MGCTs的诊断和分型中有很好临床应用价值，值得作为一线的抗体套餐推广应用于临床外检工作中。

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Combined utilization of SALL4, OCT3/4, CD117 and glypican-3 immunostaining in the diagnosis and classification of malignant germ cell tumors

Guo Weiwei1, Ao Qilin2*, Peng Xiaorong1, Dong Hua1
（1 Department of Pathology, Gongan County People’s Hospital of Hubei province, Hubei Gongan, 434300; 2Institute of Pathology,Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030 China）

ObjectiveTo investigate the value of combined detection of SALL4, OCT3/4, CD117, and Glypican-3 in the diagnosis and classification of malignant germ cell tumors (MGCT).MethodsThe expressions of SALL4, OCT3/4, CD117, and Glypican-3 proteins were detected by EnVision immunohistochemical method in 117 cases of MGCT，including 25 cases of seminomas，12 cases of dysgerminomas, 20 cases of germinomas, 18 cases of embryonal carcinomas (EC), and 42 cases of yolk sac tumors (YST). Twenty four cases of malignant non-germ cell tumors were selected as a control group，including 8 ovarian clear cell carcinomas (CCC), 6 ovarian serous carcinomas (SC) , 5 thymic carcinomas, and 5 lymphomas.ResultsSALL4 showed strong and diffusive expression in nucleus of all MGCTs cases. OCT3/4 nucleus staining was positive in seminomas (24/25), dysgerminomas(11/12), germinomas (19/20) and all EC (18/18), but negative in all 42 YSTs. The membranous expressions of CD117 in seminomas(23/25), dysgerminomas (11/12), germinomas (18/20) and YST (26/42) were positive but variable, while the staining was more focal in 2 of 18 EC. Glypican-3 staining in the cytoplasm was seen in 37 YSTs, 3 ECs, and 1 dysgerminoma with a focal pattern in the last two tumor types . In contrast, SALL4 and OCT3/4 were all negative in 24 control cases. All tumors were negative for CD117 and Glypican-3 staining except 1 SC and 1 thymic carcinoma were CD117 positive and 1 CCC was Glypican-3 positive with all threeshowing a focal staining.ConclusionSALL4 can be used as a universal immunological marker for pathological diagnosis of MGCTs clinically. OCT3/4 and CD117 show added value in the diagnosis and differential diagnosis of seminoma, dysgerminoma, germinoma and embryonal carcinoma. Positive Glypican-3 and CD117 staining can be an indicator for the diagnosis of yolk sac tumors. The combination of SALL4, OCT3/4, CD117, and Glypican-3 immunostaining has a high clinical value for pathological diagnosis and classification of MGCTs, therefore corresponding antibodies can be used for first-line detection.

Germ cell tumor; SALL4; OCT3/4; CD117; glypican-3; pathological diagnosis; immunohistochemistry

R730.43

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 06. 009

2017-07-20

2017-11-28

郭韦韦，女（1985年），汉族，主治医师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：aoqilin@263.net