NF-κB介导哮喘过敏原刺激后支气管上皮细胞的凋亡

卢福喜，余珊，王治国

（1麻城市人民医院儿科，麻城438300；2延安大学附属医院呼吸科，延安，716000）

NF-κB介导哮喘过敏原刺激后支气管上皮细胞的凋亡

卢福喜1，余珊1，王治国2*

（1麻城市人民医院儿科，麻城438300；2延安大学附属医院呼吸科，延安，716000）

目的研究核转录因子κB（NF-κB）在哮喘过敏原刺激后支气管上皮细胞中的表达及对细胞凋亡的影响。方法以300U/L尘螨抗原提取物作为过敏原刺激支气管上皮细胞系16HBE细胞，应用RT-PCR和Western blot检测尘螨抗原提取物刺激对16HBE细胞NF-κB（p65）表达水平的影响；用NF-κB（p65）shRNA沉默16HBE细胞内NF-κB表达后，应用流式细胞术和Western blot检测NF-κB（p65）在过敏原刺激诱导16HBE细胞凋亡中的作用。结果过敏原刺激后使16HBE细胞内NF-κB（p65）mRNA和蛋白水平明显上调，明显诱导16HBE细胞凋亡和活化型caspase-3水平上调，沉默NF-κB可使过敏原刺激诱导的16HBE细胞凋亡率降低和活化型caspase-3水平上调减少。结论NF-κB可介导哮喘过敏原刺激后的支气管上皮细胞凋亡。

支气管上皮细胞；凋亡；哮喘；核转录因子κB

支气管哮喘是一种发生于气道的慢性疾病，临床特征主要表现为呼吸困难、咳嗽、喘息等。据统计，在世界范围内有超过3亿的新增哮喘患者，并且其发病率呈现逐年上升的趋势[1]。支气管上皮细胞是气道内的第一个保护屏障，可以通过粘液、纤毛起到保护气道的作用。哮喘的发生与支气管上皮细胞损伤有关，也是哮喘的重要病理特征[2]。研究表明，屋尘螨可以通过作用于核转录因子κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）信号通路，诱导气道炎症发生，导致支气管上皮细胞大量凋亡[3]。NF-κB是一种快反应转录因子，可以与IκB结合后的非活性蛋白，当受到外界因素刺激后，NF-κB被激活，与IκB解离，可以特异性的作用于含有κB序列的靶基因，促进靶基因的表达[4]。NF-κB（p65）是NF-κB的亚单位，也是目前为止发现的NF-κB蛋白生物学特性发挥的必须亚单位[5]。NF-κB与炎症、肿瘤等疾病有关，参与细胞生长、凋亡、分化等过程[6,7]。为了解NF-κB是否介导哮喘过敏原刺激诱导的支气管上皮细胞凋亡，本研究检测了NF-κB在哮喘过敏原刺激后的支气管上皮细胞16HBE中的表达水平及与细胞凋亡的关系。

材料与方法

1 材料

支气管上皮细胞系16HBE细胞购自于美国ATCC；Realtime PCR试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒为美国Thermo公司产品；cDNA合成试剂盒为上海Generay公司产品； NF-κB（p65）shRNA、shRNA control为上海吉玛公司产品；NF-κB（p65）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH）引物由南京金斯瑞公司合成；NF-κB（p65）抗体、活化的caspase-3（cleaved caspase-3）抗体均为美国Santa Cruz公司产品； GAPDH抗体为美国Abcam公司产品；辣根过氧化物酶标记的二抗为北京索莱宝公司产品；ECL化学发光显色试剂盒为上海生工产品；安脱达（过敏原，尘螨抗原提取物）为丹麦 ALK-Abello A/S产品。

2 细胞培养及处理

16HBE细胞培养用含有10%胎牛血清的MEM细胞培养液，培养条件为37℃，5% CO2培养箱，观察细胞密度超过90%，按照1:3的比例用0.25%的胰蛋白酶传代培养。以每孔加入1×105个将16HBE细胞接种到6孔细胞培养板中，观察细胞密度大约为70%时，用300U/L安脱达刺激细胞24h。

3 细胞转染

16HBE细胞以每孔加入1×105个接种到6孔细胞培养板中，每孔中加入2ml的细胞悬浮液，培养过夜后，用100μl的不含血清的培养基将150ng的 NF-κB(p65) shRNA、shRNA control稀释后，用Lipofectamine2000转染至细胞中，转染后24h后进行后续处理。

4 实时定量RT-PCR

取细胞按照RNA提取试剂盒提取RNA，反转录合成cDNA， SYBR Green实时荧光定量 PCR 试剂盒检测NF-κB（p65）mRNA水平。NF-κB（p65）上游引物为 5，-ACTTGAATGCAGTGCGCCTC-3’，下游引物5，-GGGCCCGGTTATCAAAAATC-3’。GAPDH上游引物为 5，-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3’，下游引物 5，-TGTCATCATACTTGGCAGGTT-3’。实时荧光定量反应体系为：SYBR Green 1 染料10μl，上游引物和下游引物各 0.5μl，d NTP 0.5μl，Taq 酶1μl，ddH2O32.5μl；反应条件：95℃ 30s，（95℃ 5s，58℃30s，40 个循环。2-△△Ct法计算 NF-κB（p65）水平：以GAPDH为内参，取内参和目的基因的Ct值的均值，△Ct=Ct目的-Ct内参，△△Ct=[转染组目的基因Ct值-转染组内参基因Ct值]-[对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值]

5 Western blot

收集细胞提取细胞总蛋白，保存于-80℃，用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。蛋白样品与上样缓冲液混合煮沸5min后，按照每孔加入30μg蛋白样品进行上样，90V电压恒压电泳，观察溴酚蓝达到底部时停止电泳。90V电压将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，转膜在4℃条件下进行。取膜，封闭（5%牛血清白蛋白，37℃孵育60min）、一抗孵育（1000倍稀释，4℃孵育过夜）、二抗孵育（1:2000倍稀释，37孵育60min）后，ECL显色，曝光，美国BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成像系统拍照。Quantity-One软件分析目的蛋白表达水平，以GAPDH为内参计算各组蛋白的相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

6 流式细胞术

取细胞用PBS调整细胞浓度为3×106/ml。收集1ml的细胞悬浮液中的细胞，与结合缓冲液500μl混合后，与膜联蛋白 V-FITC（annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）各5μl避光孵育结合，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

7 统计学处理

采用SPSS22.0统计分析所得数据，所有数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05作为差异具有统计学意义。

结 果

1 尘螨抗原提取物刺激上调16HBE细胞NF-κB（p65）表达

以300U/L尘螨抗原提取物刺激16HBE细胞24h后进行Western blot和实时定量RT-PCR检测显示，经过敏原刺激的细胞中NF-κB（p65）及其mRNA水平均明显高于未经过敏原刺激的细胞（图1）。

图1 尘螨抗原提取物刺激对16HBE细胞内NF-κB（p65）表达的影响。A，NF-κB（p65）水平的Western blot检测；B，Western blot检测的NF-κB（p65）水平的统计学分析；C，实时定量RT-PCR检测的NF-κB（p65）mRNA水平的统计学分析；*，与对照组比较， P＜0.01Fig. 1 Effect of dust mite antigen extract stimulation on the expression of NF- κB (p65) in 16HBE cells. A, western blot detection for NF-κB（p65）level; B, statistical analysis for NF-κB（p65）level detected by western blot; C, satistical analysis for NF-κB（p65）mRNA level detected by real-time RT-PCR; *, P＜0.01, compared with the control group

2 沉默NF-κB（p65）抑制尘螨抗原提取物刺激诱导的16HBE细胞凋亡

Western blot和实时定量RT-PCR检测显示，所用NF-κB(p65) shRNA能有效沉默16HBE细胞内NF-κB(p65)表达（图2）（实时定量RT-PCR数据未显示）。

图2 NF-κB(p65) shRNA对16HBE细胞内NF-κB（p65）沉默效果的Western blot检测Fig. 2 Western blot detection on knock down efficiency of NF-κB (p65) by shRNA in 16HBE cells

细胞凋亡的annexin V-PI法流式细胞术检测和cleaved caspase-3水平的Western blot检测发现，尘螨抗原提取物刺激可明显诱导16HBE细胞凋亡和激活caspase-3；以 NF-κB (p65) shRNA 沉默 NF-κB (p65)表达后，尘螨抗原提取物刺激诱导的16HBE细胞凋亡（图3）和caspase-3激活（图4）被明显抑制。

图3 NF-κB (p65)在尘螨抗原提取物诱导16HBE细胞凋亡中作用的流式细胞术检测。A，细胞凋亡的代表性流式细胞术检测结果；B，流式细胞术检测的凋亡率的统计学分析；#，与对照组相比， P＜0.01；*，与对照＋过敏原组相比， P＜0.01Fig.3 The role of NF-κB (p65) in apoptosis induced by dust mite antigen extract stimulation in 16HBE cells. A, representative results of fl ow cytometry examination for apoptosis; B, statistical analysis for apoptotic rates detected by fl ow cytometry; #, P＜0.01, compared with control; *, P＜0.01, compared with Control + allergen group

讨 论

NF-κB主要存在于细胞浆内，参与细胞内几十种细胞因子的转录过程，其在正常状态下以非活性的形式存在，当受到病毒、紫外线、氧化剂、脂多糖、细胞因子等刺激后可以被激活。NF-κB激活后，进入细胞核内，调控含有κB的靶基因转录[8]。NF-κB是一种异源二聚体，由p65和p50组成，可以在细胞浆内与IκB结合从而以p65、p50、IκB三聚体的形式存在[9]。在p65的N端含有300个氨基酸，是一个Rel同源结构域，该结构域含有与核定位序列、DNA结合序列、二聚体形成序列结合的结构，因此也被认为是与NF-κB生物功能发挥的必需亚单位[10,11]。NF-κB与生长因子、转录因子、炎症因子、趋化因子等细胞因子有关，而这些细胞因子中的大部分与哮喘有关[12]。

图4 NF-κB (p65)在尘螨抗原提取物诱导16HBE细胞内caspase-3活化中作用的Western blot检测。A，cleaved caspase-3水平代表性Western blot检测结果；B，Western blot检测的cleaved caspase-3水平的统计学分析；#，与对照组相比，P＜0.01；*，与对照＋过敏原组相比， P＜0.01 Fig. 4 The role of NF-κB (p65) in the activation of caspase-3 induced by dust mite antigen extract stimulation in 16HBE cells. A, representative results of western blot detection for activated caspase-3 level; B, statistical analysis for activated caspase-3 level detected by western blot; #, P＜0.01, compared with control; *, P＜0.01, compared with Control + allergen group

有研究表明，哮喘大鼠中NF-κB（p65）的表达水平明显高于正常大鼠肺组织，并且NF-κB（p65）主要在气道上皮细胞及炎性细胞中表达，NF-κB在哮喘中过度激活[13]。本研究结果显示，用过敏原尘螨抗原提取物刺激后的16HBE细胞中NF-κB（p65）及其mRNA水平均升高，提示NF-κB（p65）在过敏性哮喘的支气管上皮细胞中过度表达。

气道上皮细胞具有维护上皮组织功能和结构的作用，也是气道上皮的重要组成部分[14]。当过敏原刺激气道上皮细胞以后，气道上皮细胞分泌的细胞因子可以将树突状细胞活化，导致其转变为Th2炎性细胞，诱导哮喘炎症发生，而气道上皮细胞还可以分泌IL-5等细胞因子和趋化因子，进一步维持气道的这种炎症反应，而这种反应会进一步损坏气道上皮细胞，诱导气道上皮细胞凋亡[15]。本研究表明，过敏原刺激后的16HBE细胞凋亡率增加，而下调NF-κB（p65）可以抑制过敏原诱导的16HBE细胞凋亡，说明NF-κB（p65）可介导过敏性哮喘过程中支气管上皮细胞的凋亡。Caspase级联反应激活后促进细胞凋亡，caspase-3作为caspase级联反应的凋亡执行因子，其活化后形成cleaved caspase-3标志着细胞凋亡进入不可逆的阶段[16]。本研究也检测到，过敏原刺激后的16HBE细胞中cleaved caspase-3水平显著升高，而沉默NF-κB（p65）后可以抑制过敏原升高cleaved caspase-3水平的作用，说明NF-κB（p65）可能通过影响caspase-3的活化调控支气管上皮细胞凋亡。

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NF-κB mediates the apoptosis of the bronchial epithelial cells induced by asthma allergen

Lu Fuxi1, Yu Shan1, Wang Zhiguo2*
(1Department of paediatrics, Macheng people’s hospital, Macheng 438300, china; 2Department of respiration, Yanan university affiliated hospital, Yan’an 716000, China)

ObjectiveTo study the expression of NF-κB in bronchial epithelial cells after asthma allergen stimulation and its effect on cell apoptosis.Methods300U/L dust mite antigen extract was used as the allergen to stimulate bronchial epithelial cell line 16HBE cells. The role of NF- κB (p65) in allergen induced 16HBE cell apoptosis was explored through monitoring its expression level in response to allergen treatment as well as the apoptotic rate of 16HBE cells after knocking down NF- κB using NF- κB (p65) shRNA.The NF-κB (p65) expression was determined by RT-PCR and Western blot. The apoptosis rate was measured using fl ow cytometry and Western blot.ResultsAfter allergen stimulation, NF- κB (p65) was significantly up-regulated in 16HBE cells at both mRNA and protein levels. Increased apoptosis and caspase-3 activation were observed in 16HBE cells, which can be inhibited through silencing NF- κB.ConclusionNF- κB may contribute to the apoptosis of bronchial epithelial cells induced by asthma allergen.

Bronchial epithelial cells; apoptosis; asthma; Nuclear factor-κB

R562.2+5

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 06. 005

2017-09-06

2017-12-06

卢福喜， 男（1961年），汉族，副主任医师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：595431338@qq.com