嗅觉功能活动调节豚鼠海马未成熟神经元的发育

贺旭，刘英飞，严小新，潘爱华，邓凤君

（1益阳医学高等专科学校解剖教研室，益阳 413000；2中南大学基础医学院人体解剖与神经生物学系，长沙 410013；3益阳医学高等专科学校附属医院第一内科，益阳 413000；4益阳医学高等专科学校药学系，益阳 413000）

论著

嗅觉功能活动调节豚鼠海马未成熟神经元的发育

贺旭1,2，刘英飞3，严小新2，潘爱华2，邓凤君4*

（1益阳医学高等专科学校解剖教研室，益阳 413000；2中南大学基础医学院人体解剖与神经生物学系，长沙 410013；3益阳医学高等专科学校附属医院第一内科，益阳 413000；4益阳医学高等专科学校药学系，益阳 413000）

目的观察嗅觉功能活动对豚鼠两侧海马齿状回颗粒细胞下层(SGZ)未成熟神经元表达及发育的影响。方法通过电烙铁将2月龄 (n=10) 和1岁龄 (n=10) 雄性豚鼠左侧鼻腔内嗅粘膜损伤，然后堵住鼻孔以建立嗅觉剥夺模型。将每组豚鼠编排随机数字表，随机饲养4周 (n=5) 和8周 (n=5)之后灌注取材，采用免疫组织化学技术观察2组豚鼠在2个时间点自身两侧SGZ区微管相关蛋白(doublecortin，DCX) 的表达；运用免疫荧光双标染色观察SGZ区DCX+细胞转化为NeuN（成熟神经元标记物）的频率。结果2月龄豚鼠嗅觉剥夺4周、8周后，1岁龄豚鼠嗅觉剥夺8周后，剥夺侧SGZ区DCX+细胞密度较自身非剥夺侧均显著下降；2月龄和1岁龄豚鼠嗅觉剥夺8周后，两组豚鼠嗅觉剥夺侧SGZ区DCX+细胞与NeuN+细胞共表达的频率显著低于自身未剥夺侧。结论正常的嗅觉功能活动对豚鼠海马未成熟神经元的表达及发育起调节作用。

嗅觉剥夺；豚鼠；SGZ；未成熟神经元

行为经验能从突触、细胞及循环水平影响大脑结构的形成。在关键的发育阶段进行躯体感觉、视觉系统及嗅觉的功能剥夺可引起包括皮质中枢在内的传导路径的解剖结构的改变[1-4]。研究表明早期大脑发育阶段的功能剥夺可能是神经功能紊乱和认知相关疾病的重要基础[5]。除此之外，成年经验活动继续调制突触和神经元的聚集，在非正常情况下可诱发成年后才始发的神经精神疾病[6]。因此探讨易受环境和经验影响的的大脑皮层（包括海马）神经元的发育，这将有助于我们理解正常和异常状态下神经可塑性的机制。

大鼠、豚鼠、兔子、灵长类及人的新大脑皮层以及海马等部位存在未成熟神经元[7-10]。这些细胞表达明显的未成熟神经元经典标记物，如多唾液酸神经细胞黏附分子(polysialic acid nerve cell adhesion mdecule，PSA-NCAM)和微管相关蛋白双皮质素(doublecortin，DCX)。这些表达PSA-NCAM和DCX的未成熟神经元可能在大脑结构的可塑性中具有加速微管聚合和调控细胞骨架的作用[11]。海马是边缘系统的重要组成部分，参与嗅反射径路，与嗅觉密切相关并互相影响[12]。海马的齿状回颗粒细胞下层(SGZ) 是中枢神经系统中神经发生区域之一，海马区的神经元通过轴-树、轴-体和轴-棘之间的突触联系进行信息物质的交流，从而调控神经可塑性。然而，目前鲜有报道关于正常的行为经验或生理性的神经元活动是否能调控SGZ区未成熟神经元的表达、发育及成熟，因此我们选用制作单侧嗅觉功能剥夺模型，探讨嗅觉经验对正常豚鼠SGZ区未成熟神经元的作用。

材料与方法

1 实验动物

出生后2个月及1岁的健康清洁级豚鼠，由中南大学湘雅医学院实验动物部研究中心提供。所有动物饲养于室温为(23±1)℃，每天光照12h，相对湿度为55%的动物房。给予豚鼠自由饮水及标准饮食。实验过程中尽量减少豚鼠的痛苦和应激，以及动物的使用数量。

2 实验分组

2月龄和1岁龄豚鼠各10只，左侧鼻孔堵塞后将每组豚鼠编排随机数字表，随机饲养4周 (n=5) 和8周 (n=5)。每只豚鼠左侧鼻孔为嗅觉功能剥夺侧，右侧为未剥夺侧，同只豚鼠的左、右两侧海马SGZ区（海马齿状回颗粒细胞下层）相比较。模型制备成功后4周、8周将其处死。

3 实验仪器和试剂

冰冻切片机 (Shandon 公司)、Olympus E53显微镜、Olympus BX67荧光显微镜、羊抗DCX抗体（Santa Cruz Biotechnology公司）、鼠抗NeuN抗体（Sigma 公司）、3,3-Diaminobenzidine（DAB，Vector公司），生物素化广谱IgG（Vector公司）、Alexa Fluor 488与Alexa Fluor 594 偶联驴抗山羊及驴抗大鼠IgG（Invitrogen公司）。

4 实验方法

4.1 制备单侧嗅觉功能剥夺模型

乙醚吸入麻醉豚鼠后，电烙铁插入左侧鼻孔以破坏豚鼠嗅粘膜，用 502强力胶水粘住粘膜损伤侧鼻孔，右侧鼻孔不给于任何干预。每天观察豚鼠左侧鼻孔的裂开情况，如发现裂开既用502胶水封住。模型制备成功后，2月龄和1岁龄豚鼠均饲养4周和8周，然后灌注取材。

4.2 组织学处理

以过量10%水合氯醛腹腔注射将豚鼠麻醉后，从心尖部位插入灌注针至主动脉，然后剪开右心耳。使用0.9% NaCl溶液快速冲洗，然后灌注4%多聚甲醛溶液。断头取脑，后固定过夜；脑组织置入30%蔗糖（2次）中以消除冰晶，包埋剂包埋。采用邻切法恒低温冰冻切片机切片，ABC免疫组织化学染色切片厚度30μm，免疫荧光双标切片厚度6μm。

4.3 免疫组织化学染色

选取厚度为30μm的切片含0.1%TritonX-100的0.01mol/L PBS（pH7.3）漂洗组织3次，每次10min；3% H2O2处理20min以消除过氧化物内物酶，漂洗3次，每次10min；10%马血清室温孵育2h；加入山羊抗DCX (1:1000)，4℃过夜；室温下复温20min，漂洗组织3次后加入生物素化广谱IgG(1:400)；孵育2h； ABC复合物：提前30分钟配好A液与B液(1:400)，孵育组织2h；DAB显色；脱水，脱脂透明，中性树脂封片。

4.4 免疫荧光双标染色

选取6μm切片，0.01mol/L PBS-0.1% TritonX-100(PBS-T，pH=7.3) 漂洗组织 3次，每次 10min；0.01mol/L PBS-T+5% 驴血清室温孵育2h；加入山羊抗DCX (1:1000)+鼠抗NeuN (1:4000)，4℃过夜；0.01mol/L PBS-T充分漂洗3次，每次10min；Alexa Fluor 488偶联驴抗大鼠IgG与Alexa Fluor 594驴抗山羊IgG (1:400)孵育2h；双苯酰亚胺 (bisbenzimide，1:5000) 染核；贴片，50% 甘油封片；镜下观察并拍照。

5 统计学分析

在同等曝光值和像素下应用Image pro plus 6.0图像软件分析剥夺侧和未剥夺侧SGZ区相同部位阳性细胞数。DCX+细胞计数时只统计SGZ区有胞体的细胞，只有突起不见胞体的细胞不统计。所有数据以均数±标准差表示，采用Prism Graph Pad5.0统计软件，通过双因素方差分析或者配对t检验方法检测，以P＜0.05为有统计学差异。

结 果

1 嗅觉剥夺降低2月龄豚鼠海马SGZ区DCX+细胞的表达

免疫组织化学染色显示，DCX+细胞的胞体的大小和形态不一，树突状的突起在海马区可以清晰看见，且交织成网状。许多树突状突起发出分支突向海马的颗粒细胞层(GCL)（图1A）。2月龄豚鼠左侧嗅觉剥夺4周后，剥夺侧SGZ区DCX+胞密度[(174±14.9)个/mm]较非剥夺侧SGZ区DCX+细胞密度[(204±10.2)个/mm]显著减少；左侧鼻孔堵塞8周后，剥夺侧SGZ区DCX+细胞密度[(160±14.1)/mm]也显著低于非剥夺侧SGZ区DCX+细胞密度 [(194±15.0)/mm]（图 1B）。

图1 2月龄豚鼠嗅觉剥夺对海马SGZ区DCX+细胞表达影响的免疫组织化学检测。A，2月龄豚鼠左侧嗅觉剥夺8周后SGZ区DCX+细胞表达代表图；箭头示DCX+细胞；ML，分子层；GCL，颗粒细胞层；Hi，门部；比例尺，25μm；B，DCX+细胞密度统计学分析；与非剥夺侧比较：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01Fig.1 Immunohistochemical examination for effect of olfactory deprivation on DCX+ cells in the hippocampus SGZ of 2 months old guinea pigs. A,the representative immunohistochemical images of DCX+ cells in the hippocampus SGZ of guinea pig 8 weeks after olfactory deprivation; upper panel:normal side; bottom panel: olfactory deprivation side; arrows indicate DCX+ cells; scale bar, 25μm; ML, molecular layer; GCL, granular cell layer; Hi,hilus; B, statistical analysis on the density of DCX+ cells; *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01, compared with non-deprivation side

2 嗅觉剥夺降低1岁龄豚鼠海马SGZ区DCX+细胞的表达

1岁龄豚鼠嗅觉剥夺4周后，剥夺侧SGZ区DCX+细胞密度较非剥夺侧无显著差异[(124±10.2)/mmvs(140±8.9)/mm]；左侧嗅觉功能剥夺8周后，剥夺侧SGZ区DCX+细胞密度为(104±10.2)/mm，明显低于非剥夺侧 [(132±7.5)/mm]（图2）。

3 嗅觉剥夺减少海马SGZ区DCX/NeuN细胞表达

神经元特异性核抗原(NeuN)是成熟神经元的标记物。细胞计数以DCX/NeuN双标细胞占DCX细胞的百分率代表未成熟神经元向成熟神经元的转化率。2月龄豚鼠和1岁龄豚鼠海马SGZ区均可见到DCX细胞分化为NeuN细胞（图3A）。对嗅觉剥夺是否影响豚鼠SGZ区DCX/NeuN的共表达程度检测显示，2月龄豚鼠左侧嗅觉剥夺8周后，剥夺侧DCX/NeuN双标细胞百分率为（20.2±2.6）%，非剥夺侧为（28.8±3.1）%，剥夺侧DCX/NeuN双标细胞百分率显著降低。1岁龄豚鼠左侧鼻孔堵塞8周后，剥夺侧DCX/NeuN双标细胞百分率也显著低于非剥夺侧 [（31.6±2.6）%vs（38.8±2.8）%]（图 3B）。

图2 1岁龄豚鼠嗅觉剥夺对海马SGZ区DCX+细胞表达影响的免疫组织化学检测。A，嗅觉剥夺8周后DCX+细胞在SGZ区表达的代表图；箭头示DCX+细胞；ML，分子层；GCL，颗粒细胞层；Hi，门部；比例尺，25μm；B，DCX+细胞密度统计学分析；**，与非剥夺侧比较，P＜0.01Fig. 2 Immunohistochemical examination for effect of olfactory deprivation on DCX+ cells in the hippocampus SGZ of 1 year old guinea pigs. A, the representative immunohistochemical images of DCX+ cells in the hippocampus SGZ of guinea pig 8 weeks after olfactory deprivation; upper panel:normal side; bottom panel: olfactory deprivation side; arrows indicate DCX+ cells; ML, molecular layer; GCL, granule cell layer; Hi, hilus; scale bar,25μm; B, statistical analysis on the density of DCX+ cells; **, P＜0.01, compared with non-deprivation side

图 3 2月龄和1岁龄豚鼠嗅觉剥夺8周后 SGZ 区DCX/NeuN共表达细胞免疫荧光检测。A，1岁龄豚鼠嗅觉剥夺8周海马SGZ区DCX-/NeuN共表达细胞代表图；比例尺，50μm；B，嗅觉剥夺对海马SGZ区DCX/NeuN共表达细胞影响的统计学分析；与非剥夺侧比较：**，0.001＜P＜0.01；***，P＜0.001Fig. 3 Immunohistochemical examination for effect of olfactory deprivation on DCX/NeuN co-localization cell in the hippocampus SGZ of 2 months or 1 year old guinea pigs. A, representative immunocytochemistry images on the co-localization of DCX+ cells with NeuN+ cells in the hippocampus SGZ of 1 year old guinea pigs 8 weeks after nasal occlusion; scale bar, 50μm; B, statistical analysis on the effect of olfactory deprivation on DCX/NeuN positive cells; **, 0.001＜P＜0.01; ***, P＜0.001, compared with non-deprivation side

讨 论

嗅觉系统作为最古老的系统之一，常被选用来作为体内研究生理刺激调节神经元的发育与神经可塑性的经典系统。我们先前通过电烙铁损伤单侧外周鼻孔区构建了嗅觉功能活动剥夺模型，观察了嗅觉功能活动对维持嗅球、梨状皮质未成熟神经元的发生与发育有着重要意义[13-15]，表现为经验活动依赖性的新陈代谢的改变及突触之间联系的变化[15,16]，以及嗅皮质神经元发生退变或轴、树突的变性[17,18]。本次实验研究在前期工作的基础上进一步探讨单侧堵住豚鼠鼻孔后嗅觉经验活动对海马SGZ区未成熟神经元表达的影响。

DCX作为一种微管蛋白，是未成熟神经元的标记物，表达在迁移和分化中的神经组细胞中[19]，且与突触可塑性密切相关[20,21]。DCX 主要定位于迁移神经元的胞体和前导突起中，也可表达在分化状态细胞的轴突中。该细胞表达于发育中的细胞，随着细胞的分化和成熟，其表达量也下降。实验结果显示2月龄与1岁组豚鼠海马SGZ区DCX+细胞在胞体和突起中表达明显，且2月龄组豚鼠单侧嗅觉剥夺4周和8周后、1岁组单侧嗅觉剥夺8周后剥夺侧SGZ区DCX+细胞密度显著少于未剥夺侧。这可能是嗅觉功能剥夺后，剥夺侧SGZ区神经祖细胞死亡的增加，或者是产生的未成熟神经元数目的减少；也有可能是由于单侧嗅觉剥夺也导致对侧SGZ区代偿性的功能加强反应，从而产生更多的未成熟神经元。关于2月龄豚鼠在嗅觉剥夺4、8周后，剥夺侧SGZ区DCX+细胞密度较非剥夺侧均有显著差异，而1岁龄豚鼠只在嗅觉剥夺8周后细胞密度有统计学差异，这可能是因为2月龄豚鼠大脑处于发育阶段，对嗅觉功能剥夺更加敏感。具体而言，2月龄豚鼠SGZ区DCX+细胞数目较成年豚鼠更多，因此单侧鼻孔堵塞后对2月龄豚鼠未成熟神经元数目的总体影响更早。因此，嗅觉经验活动对维持豚鼠海马SGZ区未成熟神经元的数量起着重要作用。

在成年神经再生过程中，由于海马SGZ区新生神经元形态和生化结构的发育和成熟，以及随着发育的成熟，神经元特异性核抗原NeuN+的表达出现且增加。因此SGZ区DCX+细胞与NeuN+的共表达程度可能代表着海马DCX+细胞的分化程度。本次实验结果显示在2月龄与1岁龄豚鼠嗅觉剥夺8周后，嗅觉功能剥夺侧DCX/NeuN细胞与DCX细胞的比率较未剥夺侧均显著下降。这表明嗅觉经验可能在海马SGZ区未成熟神经元的神经分化中具有成熟神经元表型的过程中起着驱动性的作用，从而参与豚鼠的嗅觉等生理功能。因此嗅觉经验可能加速未成熟海马神经元的神经化学分化。

考虑到海马SGZ区未成熟神经元对嗅觉经验具有依赖性，那么是否嗅觉经验对海马神经元的结构可塑性具有影响呢？神经元的一个基本结构特征是具有结构可塑性，目前已经发现嗅球和海马SGZ区的结构可塑性较强，表现为部分神经元替换凋亡或坏死的细胞，或者表现为神经元突起芽生[22]。我们先前研究发现嗅觉经验活动能使嗅觉剥夺侧嗅皮质未成熟神经元的胞体体积变小，且转换为成熟神经元的频率降低[15]，考虑到海马是嗅反射径路的重要组成部分，因此我们推断嗅觉经验也能调控豚鼠海马神经元的结构可塑性。当然本部分实验我们没有测量海马SGZ区凋亡神经元和突触蛋白水平，也没有观察该部位未成熟神经元的胞体及轴、树突结构的变化。这需要在接下来的实验中进一步论证。

总之，本次研究表明在早期和成年阶段的单侧嗅觉剥夺能引起豚鼠海马SGZ区剥夺侧未成熟神经元数目的减少，除此之外，嗅觉经验活动的剥夺也降低了出生后和成年阶段豚鼠SGZ区未成熟神经元转化为成熟神经元的比例。因此，正常的功能神经元活动对维持哺乳动物海马未成熟神经元的数目及神经分化成熟起着重要作用。

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Olfactory experience regulates development of immature neurons in the hippocampus of the guinea pigs

He Xu1,2, Liu Yingfei3, Yan Xiaoxin2, Pan Aihua2, Deng Fengjun4*(1Department of Anatomy, Yiyang Medical College, Yiyang 413000, China; 2Department of Anatomy and Neurobiology, School of Basic Medical Science, Central South University, Changsha 410013, China; 3 The Affiliated Hospital of Yiyang Medical College, Yiyang 413000, China; 4Department of Pharmacy, Yiyang Medical College, Yiyang 413000, China)

ObjectiveTo explore whether the olfactory deprivation could affect the development of the immature neurons in the hippocampal subgranular zone (SGZ) in both juvenile and adult guinea pigs.MethodsThe left side nasal olfactory mucosa in 2-month-old (n=10) and 1-year-old (n=10) male guinea pigs were damaged by electrocautery injury and the nostrils were then blocked to establish an olfactory deprivation model. The guinea pigs (n=10) were randomized into 4 weeks group (n=5) and 8 weeks group(n=5). The expression of doublelecortin (DCX) in the SGZ was assessed by immunohistochemistry. The co-localization of DCX+cells with NeuN+ cells was compared between injured and normal nasal mucosa using immunostaining.ResultsThe number of DCX+cells decreased in the deprived side compared to the control side in the hippocampal SGZ of both 2-month-old and 1-year-old groups.Furthermore, DCX+cells in the deprived side exhibited a lower co-localization with NeuN+cells 8 weeks after unilateral olfactory deprivation.ConclusionsNormal olfactory activity may be important to maintain the development of the immature neurons in the hippocampus of guinea pigs.

Olfactory deprivation; guinea pigs; SGZ; immature neurons

R338

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 06. 001

2017-08-16

2017-12-06

湖南省教育厅优秀青年课题 (16B269)；益阳医专科引进高层次人才科研启动费(2016-001)

贺旭，男（1984年)，汉族，讲师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：329746828@qq.com