聚对苯二甲酸-己二酸丁二酯(PBAT)降解菌的分离鉴定和降解能力测定

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所，乌鲁木齐 830091)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2017.11.016

聚对苯二甲酸-己二酸丁二酯(PBAT)降解菌的分离鉴定和降解能力测定

霍向东1，高 雁1，林 青1，曾 军1，张 涛1，楚 敏1，杨红梅1，史应武1，王 斌2，孙九胜2，王金鑫2

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所，乌鲁木齐 830091)

目的研究能够降解聚对苯二甲酸-己二酸丁二酯(Poly(butylene adipate-co-terephthalate)，PBAT)的微生物及其降解能力。方法以PBAT粉末为唯一碳源，从南疆疏勒县铺覆PBAT生物降解膜的土样中分离可有效降解PBAT聚合物的微生物，利用16S rDNA 序列对比分析进行菌株鉴定。采用失重法和扫描电镜观察，测定菌株的降解能力。结果从土壤中分离获得一株能够明显降解PBAT聚合物的细菌XJSL2，经16S rDNA 序列分析鉴定为Sphingopyxisginsengisoli，经过60 d培养，该菌株对PBAT颗粒的实际降解率达到0.92%。结论菌株XJSL2能够显著降解PBAT聚合物，对于PBAT的再生利用具有潜在应用价值，土壤中还存在着大量能够降解PBAT的微生物。

聚对苯二甲酸-己二酸丁二酯；生物降解；Sphingopyxisginsengisoli

0 引 言

【研究意义】随着农业现代化的不断发展，地膜已成为节水、防除杂草等确保农业高产稳产的重要手段之一。20世纪70年代末，中国引入地膜覆盖技术，随着地膜产品和覆膜方式的不断改进，我国地膜使用量和覆膜面积持续增加，2014 年我国地膜用量达到144.1×104t，覆盖面积超过1 800×104hm2，但是随着地膜覆盖使用年限的增加和残膜回收率低，土壤中残膜量逐步增加，一些农田的地膜残留量超过250 kg/hm2，已造成严重的白色污染[1, 2]。可生物降解地膜既具有传统地膜的功能和特性，又可以在完成功能使命后被环境微生物分解，已成为传统地膜的理想替代品[3, 4]。【前人研究进展】有许多聚合物薄膜生物降解方面的相关研究。当前研究主要集中于可降解聚羟基丁酸酯(poly(3-hydroxybutyrate) ，PHB)、聚己内酯(polycaprolactone，PCL)、聚己二酸亚乙基酯(poly(ethylene adipate) ，PEA)、聚己二酸丁二醇酯(Poly(1,4-butylene adipate)， PBA)、聚乳酸(Polylactic acid ，PLA)、聚丁二酸丁二醇酯(poly (butylene succinate)，PBS)等微生物源及合成聚合物的降解微生物分离与降解特性研究[5, 6]。聚对苯二甲酸-己二酸丁二酯(Poly(butylene adipate-co-terephthalate)，PBAT)是己二酸丁二醇酯和对苯二甲酸丁二醇酯(poly(butylece terephthalate)，PBT)的共聚物，兼具PBA和PBT的特性，既有较好的延展性和断裂伸长率，也有较好的耐热性和冲击性能[7]。PBAT作为优良的生物降解材料已应用于医药、片材、地膜、包装、发泡等领域[8]。【本研究切入点】目前大量的研究主要集中于PBAT的合成及改性[9-12]，而针对PBAT 降解菌株的分离筛选及降解特性的研究较少[13-16]。研究聚对苯二甲酸-己二酸丁二酯(PBAT)降解的分离鉴定和测定降解能力。【拟解决的关键问题】挖掘高效降解PBAT的菌株，研究其降解特性，提高环境中PBAT的降解效率，对其作为生物塑料薄膜的推广应用及其残留的生物修复。

1 材料与方法

1.1 材 料

南疆疏勒县铺覆PBAT生物降解膜的土样；PBAT颗粒，由新疆康润洁环保科技有限公司提供；PBAT粉末，PBAT颗粒冷冻粉碎成细小颗粒并过特定目数筛网。

LB培养基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 5，pH 7.0，121℃灭菌30 min。

MSM培养基(g/L)：K2HPO41，KH2PO40.2，(NH4)2SO41，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1，FeSO4·7H2O 0.01，CaCl2·2H2O 0.002，MnSO4·H2O 0.001，CuSO4·5 H2O 0.001，ZnSO4·7H2O 0.001，pH 7.0，121℃灭菌30 min。

筛选培养基：MSM培养基添加1%PBAT粉末。

1.2 方 法

1.2.1 PBAT降解菌的分离

取1 g土样稀释到10-5，取100 μL涂布筛选培养基，30℃培养72 h后，挑取培养基上生长的菌落。

1.2.2 分子鉴定

采用细菌通用引物：27F 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′与1492R 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增反应体系:上下游引物(50 pmol/μL)各0.5 μL，2×PCR mix(含Taq酶1.25 U/25 μL) 25 μL，模板DNA 2 μL，无菌ddH2O补足50 μL，阴性对照为不加模板。PCR条件：94℃ 4 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min。PCR产物由新疆昆泰锐生物技术有限公司进行测序。

利用BLAST 软件，将测到的16S rDNA 序列与EzBioCloud[17]数据库进行序列比对分析,进行同源性比较。利用MEGA6软件应用邻接法(Neighbor-Joining) 构建系统发育树[18]。

1.2.3 失重法测定菌株降解PBAT的能力

培养基的PBAT颗粒和培养基分开处理。100 mL MSM 培养基在 121℃ 条件下湿热灭菌 20 min，树脂颗粒利用干热灭菌法(105℃ 烘箱连续烘数天)。0.8～1.0 mm树脂颗粒添加到培养基前精确称取其质量M始。每瓶接4 mL LB培养基中培养24 h的菌液，设3组重复，对照组不加菌液，30℃，150 r/min培养60 d。降解培养结束后，用蒸馏水反复清洗收集的树脂颗粒，洗净后于50℃烘箱中放置3 d，精确称量M末。利用IBM SPSS Statistics 22.0进行统计分析。

树脂颗粒降解率(%)=(M始-M末)/M始×100%。

1.2.4 电镜观察

降解实验后的PBAT颗粒经喷金处理后，利用扫描电子显微镜(SEM， S-570，Japan-Hitachi Ltd，加速电压20 kV)观察表面形态特征。

2 结果与分析

2.1 16S rDNA序列的同源性比较及系统发育树

以菌株XJSL2基因组DNA为模版，采用细菌通用引物进行PCR扩增，得到1 347 bp的PCR产物。菌株XJSL2的16S rDNA序列GenBank登录号(MF461626)。经与EzBioCloud数据库中序列进行Blast相似性分析，XJSL2菌株与SphingopyxisginsengisoliGsoil 250菌株(AB245343)[19]的核苷酸序列同源性达100%。利用MEGA6.0 软件采用Neighbor-joining 法构建系统发育树，结果显示菌株XJSL2与SphingopyxisginsengisoliGsoil 250菌株(AB245343)聚为一簇，说明它们与菌株XJSL2的亲缘关系最近，可确定该菌株为Sphingopyxisginsengisoli。图1

图1 菌株XJSL2系统进化树
Fig.1 The phylogenetic tree of strain XJSL2

2.2 降解PBAT的能力

PBAT颗粒在无菌条件下保持0.48%左右的失重率，说明PBAT颗粒在无菌条件下不发生降解，0.48%的失重率是因为液体培养基浸泡及高温烘干的作用。PBAT颗粒经过 XJSL2 菌株60 d的降解作用，PBAT颗粒的降解率达到1.4%，与对照差异显著，扣除空白降解，菌株XJSL2对PBAT颗粒的实际降解率为0.92%。图2

2.3 PBAT颗粒表面SEM观察

经降解培养，取出PBAT颗粒洗净，在50°C烘箱中烘干后利用SEM观察颗粒表面的变化情况。图3A(原始颗粒)和3B(对照组，无菌液体处理)的 PBAT颗粒表面平整，二者表面没有发生明显变化；图3C(降解组，菌株XJSL2降解处理后)的PBAT颗粒可清晰看到颗粒表面结构被破坏，表面形成细微坑洞。PBAT材料在自然环境中的分解是物理、化学与生物的共同作用过程，相比自然环境，单菌株液体摇瓶的降解作用有限，所以在较短时间内，PBAT颗粒不能完全被分解破坏，只在表面发生了细微变化。图3

图2 菌株XJSL2降解PBAT的能力
Fig.2 The degrading capability of XJSL2

图3 (A)原始PBAT粉末颗粒 (B)无菌培养液中的对照PBAT粉末颗粒 (C)菌株XJSL2处理后的PBAT粉末颗粒
Fig.3 (A) Initial PBAT particle (B) PBAT particle in medium without microbia (C) PBAT particle in medium with strain XJSL2

3 讨 论

生物降解塑料是指在自然环境及微生物的生物、物理多重作用下能够降解或分解的可塑性材料。生物降解塑料按生产合成方式的不同可分为：天然高分子型生物降解塑料、微生物合成型生物降解塑料、化学合成型生物降解塑料、共混型生物降解塑料等四类[20, 21]。PBAT即属于化学合成型生物降解塑料，由于其分子中芳香族PBT链段的存在而增加了PBAT的降解难度。研究者主要从堆肥及厌氧环境中分离到一些PBAT降解微生物及从微生物中克隆能够分解PBAT的酶，如Witt分离自堆肥的耐热放线菌Thermomonosporafusca， 55℃条件下，99.9%的PBAT粉末22 d后被降解[22]、Biundo从厌氧菌PelosinusfermentansDSM 17108克隆了可降解PBAT的脂肪酶[14]、Perz从厌氧菌ClostridiumhathewayiDSM-13479分离到可降解PBAT的酯酶Chath_Est1[23]。最近，有研究者也从土壤中分离到一些中温PBAT降解微生物，如Kasuya从土壤中分离到了能够降解PBAT的3株真菌和2株细菌，其中降解速度最快的菌株NKCM1712 与玫烟色棒束孢(Isariafumosorosea)的亲缘关系相近，10 d的PBAT薄膜(1 cm×1 cm×100 um)降解率为8.4%，细菌NKCM2511、NKCM2512的10 d PBAT薄膜降解率分别为1.4%和1.2%[24]。Muroi从土壤中分离到3株与Bacilluspumilus亲缘关系较近的可降解PBAT的细菌，其中菌株NKCM3201的降解能力最强，10 d的PBAT薄膜(1 cm×1 cm×100 um)降解率为1.2%[13]。菌株XJSL2对PBAT的降解能力与真菌菌株NKCM1712、细菌菌株NKCM2511、NKCM2512、NKCM3201相比有一定差距，该差异可能与测试所用材料的不同有关。Wallace利用蛋白质组筛选技术从Pseudomonaspseudoalcaligenes中发现一种能够降解PBAT的酯酶PpEst[16]。Lee从韩国种植人参的土壤中分离到SphingopyxisginsengisoliGsoil 250菌株。如前所述，能够分解PBAT的微生物主要来源于土壤和堆肥。由于土壤中约90%～99.9%的微生物仍是未培养的[25]，土壤中一定孕育着大量还未被分离到的能够降解PBAT的微生物。

4 结 论

分离到一株能够降解PBAT的细菌菌株XJSL2，经16 S rDNA序列进化分析，其亲缘关系与Sphingopyxisginsengisoli菌株 Gsoil 250最近，可确定菌株XJSL2属于Sphingopyxisginsengisoli。经液体培养60 d后，菌株XJSL2对PBAT颗粒的实际降解率可达0.92%，其降解PBAT的特性与降解产物有待进一步的深入研究。菌株XJSL2在以PBAT为主要原料的生物降解薄膜的再生利用中具有潜在应用价值。

参考文献(References)

[1] 严昌荣, 刘恩科, 舒帆, 等.我国地膜覆盖和残留污染特点与防控技术[J]. 农业资源与环境学报, 2014, 31(2): 95-102.

YAN Chang-rong，LIU En-ke，SHU Fan, et al. (2014). Review of agricultural plastic mulching and its residual pollution and prevention measures in China [J].JournalofAgriculturalResourcesandEnvironment, 31(2): 95-102. (In Chinese)

[2] 严昌荣, 何文清, 薛颖昊, 等. 生物降解地膜应用与地膜残留污染防控[J]. 生物工程学报, 2016, 32(6): 746-760.

YAN Chang-rong, HE Wen-qing, XUE Ying-hao, et al. (2016). Application of biodegradable plastic film to reduce plastic film residual pollution in Chinese agriculture [J].ChineseJournalofBiotechnology, 32(6): 748-760. (In Chinese)

[3] 李淑芬，于九皋，宋永霞，等. 可降解塑料的研究进展[J]. 化学工业与工程, 1994, (3): 1-10.

LI Shu-fen,YU Jiu-gao, SONG Yong-xia, et al. (1994). Progress in Study of Degradable Plastics[J].ChemicalIndustryandEngineering, (3):1-10. (In Chinese)

[4]钱伯章, 朱建芳. 生物可降解塑料发展现状与前景[J]. 现代化工, 2008, (11):82-85, 87.

QIAN Bo-zhang, ZHU Jian-fang. (2008). Current status and prospect for biodegradable plastics[J].ModernChemicalIndustry, (11):82-85, 87. (In Chinese)

[5]Kim, D. Y., & Rhee, Y. H. (2003). Biodegradation of microbial and synthetic polyesters by fungi.AppliedMicrobiology&Biotechnology,61(4): 300-308.

[6]毛海龙, 白俊岩, 姜虎生, 等.可降解塑料的微生物降解研究进展[J]. 微生物学杂志, 2014, 34(4):80-84.

MAO Hai-long，BAI Jun-yan，JIANG Hu-sheng，et al. (2014). Research progress on microbial degradation of degradable plastics [J].JournalofMicrobiology, 34(4):80-84.(InChinese)

[7]马一萍, 张乃文, 杨军伟, 等.PBAT的制备与性能[J]. 塑料, 2010, 39(4): 98-101.

MA Yi-ping, ZHANG Nai-wen, YANG Jun-wei, et al. (2010). Preparation and properties of PBAT [J].Plastics, 39(4):98-101.(In Chinese)

[8]王有超. 新型生物降解材料-PBAT的连续生产工艺[J]. 聚酯工业, 2016, 29(1): 28-29.

WANG You-chao. (2016). A new biodegradable plastic-polybutylene terephthalate adipate continuous production process [J].PolyesterIndustry, 29(1):28-29. (In Chinese)

[9]王秋艳, 许国志, 翁云宣.PPC/PBAT生物降解材料热性能和力学性能的研究 [J]. 塑料科技, 2011, 39(6): 51-54.

WANG Qiu-yan,XU Zhi-guo,WENG Yun-xuan. (2011). Research on thermal and mechnical properties of PPC/PBAT biodegradable material [J].PlasticsScienceandTechnology, 39(6):51-54. (In Chinese)

[10]王勋林, 吴胜先. PPC/PBAT共混复合材料性能的研究[J]. 塑料科技, 2012, 40(10): 70-73.

WANG Xun-lin ,WU Sheng-xian. (2012). Study on Properties of PPC/PBAT Blends [J].PlasticsScienceandTechnology, 40(10):70-73. (In Chinese)

[11]杨冰, 张自强, 张以河, 等.PBAT/PLA薄膜的制备及性能研究[J]. 中国塑料, 2015, 29(3):5-50.

YANG Bing, ZHANG Zi-qiang, ZHANG Yi-he, et al. (2015). Preparation and properties of PBAT/PLA film [J].ChinaPlastics, 29(3):45-50. (In Chinese)

[12]刘伟, 任粒, 张纯, 等.硅酸钙对PBAT流变性能与发泡行为的影响[J]. 工程塑料应用, 2017, 45(3):116-120, 141.

LIU Wei, REN Li, ZHANG Chun, et al. (2017). Rheology properties and foaming behavior of PBAT/Calcium silicate composite [J].EngineeringPlasticsApplication, 45(3):116-120, 141.

[13]Muroi F, Tachibana Y, Soulenthone P, et al. (2017). Characterization of a poly (butylene adipate-co -terephthalate) hydrolase from the aerobic mesophilic bacterium bacillus pumilus.PolymerDegradationandStability, (137): 11-22.

[14]Biundo, A., Hromic, A., Pavkovkeller, T., Gruber, K., Quartinello, F., & Haernvall, K., et al. (2016). Characterization of a poly(butylene adipate-co-terephthalate)-hydrolyzing lipase from pelosinus fermentans.AppliedMicrobiology&Biotechnology, 100(4): 1,753-1,764.

[15]Müller, C. A., Perz, V., Provasnek, C., Quartinello, F., Guebitz, G. M., & Berg, G. (2017). Discovery of polyesterases from moss-associated microorganisms.ApplEnvironMicrobiol, 83(4): AEM. 2,641-2,616.

[16]Wallace, P. W., Haernvall, K., Ribitsch, D., Zitzenbacher, S., Schittmayer, M., & Steinkellner, G., et al. (2017). Ppest is a novel pbat degrading polyesterase identified by proteomic screening ofpseudomonas pseudoalcaligenes:.AppliedMicrobiology&Biotechnology, 101(6): 2,291-2,303.

[17]Yoon, S. H., Ha, S. M., Kwon, S., Lim, J., Kim, Y., & Seo, H., et al. (2017). Introducing ezbiocloud: a taxonomically united database of 16s rrna gene sequences and whole-genome assemblies.InternationalJournalofSystematic&EvolutionaryMicrobiology, 67(5):1,613-1,617.

[18] Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski ，A. & Kumar S. (2013).MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0.MolBiolEvol. 30(12): 2,725-2,729.

[19] Lee M, Ten LN, Lee HW, et al. (2008). Sphingopyxis ginsengisoli sp. Nov., isolated from soil of a ginseng field in south korea.IntJSystEvolMicrobiol, (58): 2,342-2,347.

[20]张远, 陶树明, 邱小云, 等.生物降解塑料及其性能评价方法研究进展[J]. 化工进展, 2010, 29(9):1 666-1 674.

ZHANG Yuan，TAO Shu-ming，QIU Xiao-yun, et al. (2010). Research progress in biodegradable plastics and their properties characterization [J].ChemicalIndustryAndEngineeringProgress, 29(9):1,666-1,674. (In Chinese)

[21]魏晓晓, 张梅, 李琴梅, 等. 生物降解塑料国内外标准概况[J]. 标准科学, 2016, (11):58-64.

WEI Xiao-xiao, ZHANG Mei, LI Qin-mei, et al. (2016). Review of biodegradable plastics standards [J].StandardScience, (11):58-64. (In Chinese)

[22]Witt, U., Einig, T., Yamamoto, M., Kleeberg, I., Deckwer, W. D., & Müller, R. J. (2001). Biodegradation of aliphatic-aromatic copolyesters: evaluation of the final biodegradability and ecotoxicological impact of degradation intermediates.Chemosphere, 44(2): 289-299.

[23]Perz, V., Hromic, A., Baumschlager, A., Steinkellner, G., Pavkovkeller, T., & Gruber, K., et al. (2016). An esterase from anaerobic clostridium hathewayi can hydrolyze aliphatic-aromatic polyesters.EnvironmentalScience&Technology, 50(6): 2,899-2,907.

[24]Kasuya, K., Ishii, N., Inoue, Y., Yazawa, K., Tagaya, T., & Yotsumoto, T., et al. (2009). Characterization of a mesophilic aliphatic-aromatic copolyester-degrading fungus.PolymerDegradation&Stability, 94(8): 1,190-1,196.

[25]Cowan, D. A., Arslanoglu, A., Burton, S. G., Baker, G. C., Cameron, R. A., & Smith, J. J., et al. (2004). Metagenomics, gene discovery and the ideal biocatalyst.BiochemicalSocietyTransactions, 32(Pt 2): 298-302.

IsolationandidentificationofPoly(butyleneadipate-co-terephthalate) -degradingBacteria

HUO Xiang-dong1, GAO Yan1, LIN Qing1, ZENG Jun1, ZHANG Tao1, CHU Min1,YANG Hong-mei1, SHI Ying-wu1, WANG Bin2, SUN Jiu-sheng2, WANG Jin-xin2

(1.ResearchInstituteofAppliedMicrobiology/XinjiangSpecialEnvironmentalMicrobiologyLaboratory,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.ResearchInstituteofSoil,FertilizerandAgriculturalWaterConservation,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

ObjectiveTo isolate poly (butylene adipate-co-terephthalate)-degrading bacteria and study the capability of biodegradation of the bacteria.MethodUsing PBAT powder as the sole carbon source to isolate Poly (butylene adipate-co-terephthalate)-degrading bacteria from the soil which was covered with PBAT mulch. The strain was identified by 16S rDNA sequence comparative analysis. The degradation capability of strain in the liquid medium was evaluated by weight loss method and scanning electron microscope.Result1 Poly (butylene adipate-co-terephthalate) - degrading bacteria was isolated and identified asSphingopyxisginsengisoli. In the liquid medium, degradation rate of PBAT reached up to 0.92% after 60 days.ConclusionTheSphingopyxisginsengisolistrain XJSL2 can be used to recycle of PBAT mulch. There are still a lot of soil microorganisms able to degrade PBAT, This still needs further research.

poly (butylene adipate-co-terephthalate); biodegradation;Sphingopyxisginsengisoli

Supported by: The Key Research and Development Program of Xinjiang Uygur Autonomous Region "Biodegradable Plastic Film Innovation Project"(2016B02017-4); The National Natural Science Foundation of China"Metagenomic Library Construction of the Rumen Microbe from Xinjiang Bactrian Camel and cellulase Family Research" ( 31160027)；The Special Funding for Enhancing the Agricultural Scientific and Technological Research Innovation Platform of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences-Xinjiang Laboratory of Special Environmental Microbiology"(XJNKYPT-2017-002)

Huo xiang-dong(1974-),male,Gansu province,associate professor,microbial resources,(E-mail)xiangdonghuo@163.com

S188

A

1001-4330(2017)11-2086-06

2017-09-30

新疆维吾尔自治区重点研发项目“生物降解地膜创新工程”(2016B02017-4); 国家自然科学基金项目“新疆双峰驼瘤胃微生物宏基因组文库构建和纤维素酶系的研究”(31160027)；“新疆农业科学院农业科技创新平台能力提升建设专项-新疆特殊环境微生物实验室”(XJNKYPT-2017-002)

霍向东(1974-)，男，甘肃人，副研究员，研究方向为微生物资源，(E-mail)xiangdonghuo@163.com