不同产地及品种大蒜内生菌群落多样性分析及拮抗作用测定

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2017.11.014

不同产地及品种大蒜内生菌群落多样性分析及拮抗作用测定

楚 敏1，张丽娟1，刘晓静2，朱 静1，王 玮1，顾美英1，谢玉清1，张志东1

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)

目的调查分析不同产地及不同品种大蒜内生菌的群落多样性，测定内生菌对5株病原菌的拮抗作用。方法以新疆、山东的白皮蒜、红皮蒜为研究材料，采用BIOLOG生态板法和培养基培养法进行大蒜内生菌群落多样性的分析，并利用平板对峙法，利用大蒜内生菌对立枯丝核菌(Rhizoctoniasoleni)、棉花枯萎病菌棉花枯萎病菌 (Fusariumoxysporumf)、扩展青霉 (Penicilliumexpansum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)的拮抗作用进行研究。结果不同品种来源的大蒜内生菌群落代谢活性均较低，但不同类型碳源利用活性存在明显分布规律；初步筛选获得的45株内生菌，分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆属(Paenibacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis) 和迪茨菌属(Dietzia) 等5个属15个种，其中芽孢杆菌属菌株占绝大部分，占85%以上，且在不同大蒜样品中均为优势菌，但种间分布存在着差异。获得了24株具有拮抗作用的内生菌菌株。结论大蒜内生菌群落多样性较为简单，存在着具有拮抗作用的微生物资源，有待进一步开发利用。

大蒜品种；不同产地；内生菌；拮抗菌

0 引 言

【研究意义】植物内生菌(Endophyte)是指存活于健康植物组织内部，而又不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物类群，目前所有研究过的植物中均发现有内生菌。植物内生真菌的研究，不仅在系统分类学、生物多样性和生态学研究上具有重要的理论意义，也在工农业生产、生物医药以及基因操作应用上具有广泛的应用价值[1-5]。【前人研究进展】大蒜AlliumsativumL.(Garlic)，为半年生草本植物，百合科葱属，为食药同源的植物[6,7]，通常称谓大蒜是指其鳞茎。《本草纲目》记载，大蒜“其气熏烈，能通五脏，去寒湿，辟邪恶”。 近代科学研究表明, 大蒜营养成分丰富，其中以蒜氨酸为代表的大蒜含硫氨基酸具有独特的药理活性[89]。同时，大蒜是天然的植物杀菌素，被世界医学界称为“二十一世纪在天然食药物领域中的最伟大神奇发现之一”[11]。崔北米等[12]首次对大蒜的内生菌进行了分离，获得19株芽孢杆菌；邓振山等[13]利用大蒜内生菌进行了番茄灰霉病防治进行了研究，取得了较好的结果。【本研究切入点】大蒜在我国种植历史久远，分布区域广，种类多[14]，为研究植物内生菌的分布和组成提供了良好的材料。然而，有关大蒜内生菌的研究，仅有零星报道[13-15]。研究不同产地及不同品种大蒜内生菌的群落多样性及拮抗作用测定。【拟解决的关键问题】研究分别对产地为新疆和山东的红皮大蒜、白皮大蒜的内生菌群落代谢特征及菌群多样性进行分析，并对内生菌菌株拮抗特性进行测试，为进一步阐述大蒜内生菌菌群分布和开发利用其内生菌资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

保存完好新鲜的新疆红皮蒜(产地吉木萨尔县)、新疆白皮蒜(产地吉木萨尔县)、山东红皮蒜(产地金乡县)、山东白皮蒜(产地金乡县)，购自乌鲁木齐北园春蔬菜批发市场。

1.1.2 测试菌株

立枯丝核菌(Rhizoctoniasoleni)、棉花枯萎病菌棉花枯萎病菌 (Fusariumoxysporumf)、扩展青霉 (Penicilliumexpansum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus), 均由新疆农业科学院微生物应用研究所菌种保藏室提供。

1.1.3 筛选培养基

完全培养基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，磷酸氢二钾 3.0 g，葡萄糖1.0 g，琼脂15 g/L，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

MM培养基：胰蛋白胨5.0 g，牛肉膏1.5 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖2.0 g，磷酸氢二钾3.0 g，氯化钠5.0 g，硝酸钾1.0 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂15 g，水1 000 mL，pH 7.5。

其它常见培养基：马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA)，营养琼脂培养基(NA)，高氏一号培养基(Gause' s No.1)。

1.2 方 法

1.2.1 表面消毒

选取健康的大蒜，去皮，自来水冲洗干净，用无菌滤纸吸干水分，70%无水乙醇的表面消毒时间为4 min，无菌水洗浄，无菌滤纸吸干水分；然后3%双氧水浸泡5min，最后用无菌水冲洗10遍后，无菌滤纸吸干水分，备用。同时将冲洗的无菌水涂布于平板，以检测表面消毒的完全[14，15]。

1.2.2 内生微生物群落碳源代谢利用测定[16,17]

在无菌条件下，称取20 g表面消毒完全的大蒜放入无菌的果汁均浆杯中，加入200 mL生理盐水，进行组织破碎匀质5 min后，静止20 min。吸取上述上清液加入Biolog Eco 生态板中，每微孔加150 μL。然后将微平板放置于30 ℃恒温培养箱内温育。采用Biolog 分析鉴定系统进行样品测定，每24 h 读板1次，连续读7 d[15]。

1.2.3 内生菌的分离筛选

吸取前述大蒜组织上清液进行梯度稀释，分别涂布在筛选培养基平板中，放置在30 ℃恒温培养，并逐日观察。挑取具有不同形态的单菌落，划线纯化。经合并整理，接种入相关培养基斜面保存，供后续使用。

1.2.4 菌株的分子鉴定

采用菌落克隆方法，利用细菌16S rRNA 基因通用引物27F和1492R进行PCR扩增。PCR产物经切胶纯化回收后，送往北京鼎国生物技术有限公司进行测序，所测得序列去除载体序列后，将有效序列在EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)数据库上进行比对，调取同源性最高模式菌株序列, 使用MEGA5.0进行CLUSTAL X多重比对，使用NJ法构建系统发育树[18]，自举值为(Bootstrap) 为1000。

1.2.5 拮抗菌株的筛选

使用无菌生理盐水，分别配制不同测试菌株的孢子或菌悬液，真菌孢子悬液控制在104～105CFU/mL，细菌悬液控制在106～107CFU/mL，取0.2mL涂布于不同培养基上，30 ℃恒温放置30 min，待平板水分吸干后，点接筛得的内生菌，然后置于30 ℃恒温培养3～5 d，观察菌株生长情况和菌株间的拮抗现象[15]。

1.3 数据处理[16,17]

微平板孔中溶液吸光值平均颜色变化率(Average well color development, AWCD)用于描述样品微生物代谢活性，计算公式如下：AWCD= (Ci﹣Ri)/n式中，Ci为每个有培养基孔的吸光值，Ri为对照孔的吸光值，n为培养基孔数，Biolog Eco板n值为31。采用Simpson、Shannon-Wiener和McIntosh三个指数来表征土壤微生物群落功能和种群多样性。其中Simpson指数(D)用于评估群落物种的优势度，Shannon-Wiener指数(H)用于评估群落物种的丰富度，McIntosh指数(U)用于评估群落物种均匀度。

采用DPS v9.50版软件进行平均吸光值(AWCD)、多样性指数、及相关性分析等。

2 结果与分析

2.1 大蒜内生菌代谢多样性

2.1.1 内生菌代谢活性

Biolog-Eco 每孔颜色平均变化率(AWCD)是表征样品中微生物群落对底物碳源利用强度的指标，反映样品中微生物活群落活性的一个重要指标[16]。研究表明，不同来源和不同品种的大蒜内生菌AWCD值随培养时间的延长而提高。在开始的24 h内，各个样品的AWCD值明显提高，随后(新疆红皮蒜72 h后)表现出缓慢增长的趋势。在整个培养期间，各样品的AWCD值均不超过0.15，表明大蒜内生菌的代谢活力均较低。但总体来说，各个样品间微生物活性表现从高到低为新疆白皮蒜﹥山东红皮蒜﹥新疆红皮蒜﹥山东白皮蒜。图1

图1 不同品种产地大蒜内生菌AWCD值
Fig.1 AWCD of endophytes in Garlic varieties from different producing areas

2.1.2 不同类型碳源利用的差异

为了进一步分析不同来源和不同品种大蒜内生菌群落的代谢功能多样性，根据各样品AWCD具体变化情况，选取96h的各样品进行了内生菌群落不同类型碳源利用的差异分析，此时AWCD值趋于稳定，且各样品间分形较好。

通过AWCD值来看，新疆白皮蒜活性最高，而山东红皮蒜活性最低。从不同来源和不同品种大蒜内生菌对六类碳源代谢利用来看，存在明显的差别和分布规律。大蒜内生菌群落代谢糖类碳源百分比，从低到高按山东红皮蒜<山东白皮蒜<新疆红皮蒜<新疆白皮蒜的顺序排列，而代谢多聚类化合物碳源百分比，则从高到低按山东红皮蒜>山东白皮蒜>新疆红皮蒜>新疆白皮蒜的顺序排列。从不同来源大蒜来看，新疆大蒜内生菌在代谢利用糖类碳源和羧酸类碳源百分比均高于山东大蒜，而山东大蒜内生菌代谢多聚类化合物碳源百分比高于新疆大蒜。从大蒜种质分析，白皮大蒜内生菌代谢糖类碳源和氨基酸类碳源的百分比均高于红皮大蒜，但红皮大蒜内生菌代谢多聚类化合物和胺类碳源的百分比均高于白皮大蒜。图2

图2 不同品种产地大蒜内生菌对6类碳源的利用情况
Fig.2 Utilization of 6 types of carbon sources by endophytes in Garlic varieties from different producing areas

2.1.3 土壤微生物群落功能多样性指数

进一步分析土壤微生物群落多样性结果表明，各样品间AWCD值在0.132～0.068，差异显著性分析表明，不同来源的样品间碳源利用活性差异显著(ρ﹤0.05)，代谢活性呈现山东红皮蒜>山东白皮蒜>新疆红皮蒜>新疆白皮蒜。多样性指数分析结果显示，各样品微生物Shannon-Wiener丰富度指数差异不大，表明各样品间内生菌多样性差别不大，但Simpson优势度指数和McIntosh均匀度指数间差异显著，且呈现一定规律，即Simpson优势度指数山东红皮蒜>山东白皮蒜>新疆红皮蒜>新疆白皮蒜，而McIntosh均匀度指数相反，表明山东大蒜内生菌优势菌群较新疆群落内物种数量分布不均匀，优势种的地位突出，且红皮蒜大于白皮蒜。表1

表1 不同品种产地大蒜内生菌群落功能多样性指数
Table 1 Diversity indices of endophytes in Garlic varieties from different producing areas

SamplesAWCDSimpson(D)Shannon(H)McIntosh(U)山红0.132±0.011a1.721±0.111a2.723±0.052a0.886±0.073d山白0.097±0.005b1.673±0.211a2.528±0.032b1.208±0.036c新红0.087±0.017c1.443±0.132b2.749±0.091a1.452±0.056b新白0.068±0.006d0.953±0.087c2.646±0.087ab1.783±0.067a

注：每组同列的不同字母表示差异显著性水平。小写字母为5%显著水平

Note：Letters in same column and same block represented significant differences. Small letters wereP﹤0.05

2.2 内生菌多样性

2.2.1 内生菌的分离及鉴定

通过反复分离纯化共获得可培养的微生物100余株，经菌落、菌株形态观察，上述菌株合并为45株其中细菌43株，均为革兰氏阳性菌；放线菌2株，未发现真菌。

通过测序获得16S rRNA基因序列，与GENEBANK中序列比对并进行系统发育树分析，所得到的45株内生菌分离株分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆属(Paenibacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)和迪茨菌属(Dietzia)的5个属15个种内，其中芽孢杆菌属菌株占绝大部分，占85%以上。图3

图3 大蒜内生细菌系统发育进化树拓扑图
Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on partial16S rRNA of endophytes in Garlic varieties from different producing areas. Numbers on the nodes are the bootstrap values (percentages) based on 1,000 replicates and values of above 50% were presented

2.2.2 内生菌的分布

对不同品种及来源分布不同的大蒜内生菌进行分析，结果表明：山东红皮蒜分离到内生菌种类最多，共涉及9种，其它样品中分离的内生菌均为7种。芽孢杆菌为大蒜内生菌主要优势菌群，涉及11个种，但除B.tequilensis和B.pumilus在四种样品中均发现外，其它种的芽孢杆菌在样品间仍有细微差别。表2

2.3 拮抗菌株的筛选

选取有功能活性的45株菌株进行平板对峙试验，测定这45株大蒜内生菌对5种病原菌的拮抗作用。发现有24株菌株具有不同程度的抑菌效果，其中单独抑制细菌的有7株，单独抑制真菌的有14株，另有3株对实验选用的真菌和细菌均有抑制效果。表3

表2 不同品种产地大蒜内生菌分布
Table 2 Community composition of endophytes in Garlic varieties from different producing areas

种属Genus来源及品种Garlicvarietiesfromdifferentproducingareas山东红皮蒜RedGarlicfromShangdong山东白皮蒜WhiteGarlicfromShangdong新疆红皮蒜RedGarlicfromXinjiang新疆白皮蒜WhiteGarlicfromXinjiangB.subtilissubsp.inaquosorum++B.mojavensis++B.tequilensis++++B.methylotrophicus+B.sonorensis++B.altitudinis++B.pumilus++++B.aryabhattai++B.anthracis++B.cereus++B.toyonensis++P.taichungensis++S.pratensis+D.cercidiphylli+N.dassonvillei+

注：+为存在

Note: +exist

表3 部分大蒜内生菌抑菌特性
Table 3 Partial results of screening on the antagonism

株编号Isolates大肠杆菌E.coli金黄色葡萄球菌S.aureus扩展青霉P.expansum立枯丝核菌R.soleni大丽轮枝菌F.oxysporumfSH1++++++、+SB-1++-+++XB-5--+++++XB-18--++++++SH-3++---XH20---++XB-6+----

注：-为无抑圈菌；+为有抑圈菌；++为抑圈菌直径比大于1.5 cm

Note: - no inhibition zone; + inhibition zone; ++ inhibition zone R more than 1.5 cm

3 讨 论

研究首次通过Biolog Eco生态板对来源于山东和新疆的红皮大蒜和白皮大蒜内生菌的代谢多样性及分布进行了研究。研究发现，新疆白皮蒜内生菌代谢活性最高，而山东红皮蒜活性最低，但总体来说大蒜内生菌的代谢活性均较低，这可能与大蒜自身具有广谱抗菌能力有关。对六类碳源代谢利用情况分析，内生菌群代谢存在产地和品种间差别和规律；多样性指数分析结果显示，各样品间大蒜内生菌群多样性差别不大，但Simpson优势度指数和McIntosh均匀度指数间差异显著，且呈现一定规律，即Simpson优势度指数山东红皮蒜>山东白皮蒜>新疆红皮蒜>新疆白皮蒜，而McIntosh均匀度指数相反，表明山东大蒜内生菌优势菌群较新疆群落内物种数量分布不均匀，优势种的地位更突出，且红皮蒜大于白皮蒜。

目前有关大蒜内生菌的研究表明，大蒜的内生菌种群组成存在地域间的差别，已发现内生菌均为原核微生物，未发现真核微生物，芽孢杆菌属菌株为其优势菌群[13-15]。研究通过多种培养基对大蒜内生菌进行了初步分离筛选，共获得了微生物100余株，经形态学观察合并为45株，分子鉴定确定为细菌和放线菌，未发现真菌，与现有对大蒜内生菌的研究结果一致；45株菌株分属于芽孢杆菌属、类芽孢杆属、链霉菌属、拟诺卡氏菌属和迪茨菌属的5个属15个种内，种群组成明显有别于现有有关大蒜内生菌的报道。但芽孢杆菌属为大蒜内生菌的优势菌群，这一结果与相关报道一致。

同时，大蒜是天然的植物杀菌素，对致病的葡萄球菌、化脓性球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌等，都有明显的抑菌和杀菌作用[7,10]；对不少细菌性、真菌性和原虫性感染，均有治疗和预防价值[7,11,12]。研究发现分离的内生菌中普遍存在不同性能的抑菌性，且有3株内生菌株对实验选用的多种植物致病真菌和致病细菌均有良好的抑菌效果，这一结果为进一步利用大蒜内生菌进行农作物生物防治，以及了解内生菌与植物间相互适应和进化提供了材料。

4 结 论

4.1 大蒜内生菌群代谢活性均较低，但存在着差别，其中新疆白皮大蒜活性最高，而山东红皮蒜活性最低。各样品间大蒜内生菌群多样性差别不大，但山东大蒜内生菌菌群较新疆群落内物种数量分布不均匀，且红皮蒜大于白皮蒜。

4.2 开展了45株代表菌株的鉴定，确定分属于芽孢杆菌属、类芽孢杆属、链霉菌属、拟诺卡氏菌属和迪茨菌属的5个属15个种，芽孢杆菌属菌株为大蒜内生菌的优势菌群。

4.3 获得了24株具有抑菌作用的菌株，其中单独抑制细菌的有7株，单独抑制真菌的有14株，另有3株内生菌对实验选用的真菌和细菌均有抑制效果。

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DiversityoftheendophytesandscreeningofantagonisticmicrobesinGarlicvarietiesfromdifferentproducingareas

CHU Min1, ZHANG Li-juan1, LIU Xiao-Jing2, ZHU Jing1, WANG Wei1, GU Mei-ying1,XIE Yu-qing1, ZHANG Zhi-dong1

(1.InstituteofMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091;2.DepartmentofFoodScience,CollegeofFoodScienceandPharmaceuticalScience,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052)

ObjectiveIn order to investigate diversity of the endophytes in Garlic varieties from different producing area, and obtain antagonistic microbes.MethodGarlic varieties, white garlic and red garlic from different producing areas were sampled. And then, Biolog Eco method was employed to investigate metabolic characteristics of endophytes. Meanwhile, Endophytes were isolated and antagonistic bacteria toRhizoctoniasoleni，Fusariumoxysporumf，Penicilliumexpansum，EscherichiacoliandStaphyloccocusaureuswere screened.ResultLow metabolic activity of endophytes in Garlic were determined, and some differences in the utilization and diversity in Garlic varieties from different producing areas were analyzed. 45 endophytes were isolated which were involved in 15 species belonging to genus Bacillus, genusPaenibacillus, genusStreptomyces, genusNocardiopsis, and genusDietz. Isolates in GenusBacilluswere dominant in Garlic endophytes, accounted for more than 85%, but there were differences in the distribution of species. Additionally, lots of antagonistic bacteria were obtained.ConclusionDiversity of the endophytes in Garlic varieties from different producing area were all poor, but effective resource of antagonistic microbes needs further explore.

Garlic varieties; different producing areas; endophytes; antagonistic microbes

Supported by: Natural Science Funds of Xinjiang Uygur Autonomous Region (No.2014211B033)

ZHANG Zhi-dong(1977-), male, native place:Urumqi,Xinjiang, researcher, Master，research field:Microbial ecology， (E-mail)zhangzheedong@sohu.com

S188

A

1001-4330(2017)11-2067-08

2017-08-18

新疆维吾尔自治区自然基金项目“新疆大蒜根腐病病原菌分离鉴定及发病规律动态分析”(2014211B033)

楚敏(1977-)，女，新疆乌鲁木齐人，副研究员，硕士，研究方向为分子生物学与微生物学，(E-mail)chuliu2002@163.com

张志东(1977-)，男，新疆乌鲁木齐人，研究员，硕士，研究方向为微生物生态，(E-mail)zhangzheedong@sohu.com