基于分子检测新疆东部棉花根茎部病害种类及其分布

(新疆农业大学/新疆农业大学农学院农林有害生物监测与安全防控重点实验室，乌鲁木齐 830052)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2017.11.011

基于分子检测新疆东部棉花根茎部病害种类及其分布

马依努尔·米吉提，族米娜，萨吉达·艾孜则，郭庆元

(新疆农业大学/新疆农业大学农学院农林有害生物监测与安全防控重点实验室，乌鲁木齐 830052)

目的研究新疆东部棉花根茎部病害的种类及分布，为当地高效防控此类病害提供依据。方法采用已报道的4种引起棉花根茎部病害的主要病原菌(尖孢镰孢霉、立枯丝核菌、大丽轮枝菌和拟轮枝镰孢霉)的特异性引物，特异性验证后，分别对新疆东部棉花区按不同以村(连)为单位采集的混合病样进行PCR检测。结果在检测灵敏度为0.5 ng/μL的检测体系中，从22份新疆东部棉花病株混合样品中可以检测出4种病原菌中的3种，分别为尖孢镰孢霉、立枯丝核菌、大丽轮枝菌;其中尖孢镰刀菌检出率最高，立枯丝核菌检出率次之，大丽轮枝菌检出率较低；而拟轮枝镰孢霉在22份混合病样中的检出率0%。结论枯萎病、立枯病和黄萎病是新疆东部根茎部主要病害；其中枯萎病的发生最为普遍，立枯病次之，黄萎病发生的普遍率相对较低，红腐病在新疆东部无发生或发生分布极少。

棉花；根茎部病害；PCR检测；病害分布

0 引 言

【研究意义】我国种植棉花的历史大约有2000年，植棉业一直是我国农业的支柱性产业之一，总产量居世界前列[1]。新疆是全国最大的棉花生产基地。新疆棉花生产过程中，病虫害问题越来越突出，由于病虫害的影响，每年造成的产量损失可达20%左右，已经成为了限制新疆棉花产量和质量的重要因素[1]。据文献记载我国棉花病害有50多种，造成减产威胁的重要棉花病害有近20多种[2]。新疆棉花常见病害有枯萎病、黄萎病、立枯病、红腐病、炭疽病和细菌性角斑病等。其中, 棉花枯萎病、黄萎病、立枯病和红腐病是新疆常年发生的土传维管束病害。枯萎病和黄萎病是危害棉花茎秆的重要病害，棉田一旦感染这两种病害就会常年受害，发病轻的造成减产，发病重的导致绝收，而且防治十分困难[3]。立枯病是棉花苗期的主要根病之一，属于世界性的病害，也是我国分布最广的棉苗根病[4]，在新疆棉区一直是棉花苗期最严重病害。棉花红腐病也是棉花苗期根茎部重要病害之一，该病易引起芽变及根茎部红褐色腐烂[5]，该病的发生与湿度关系密切，多雨、低温和空气湿度大时易使该病严重发生[6]，据相关调查，该病在新疆常在特定年份或特定地区有较严重发生。由于种子处理技术改进，加上新疆气候干燥，细菌性角斑病和炭疽病在新疆发生较少，危害较轻。因此棉花枯萎病、黄萎病、立枯病和红腐病是新疆棉花生产最主要的4种病害。根据现有的研究报道，这4种棉花病害分别由尖孢镰孢霉(FusariumoxysporumSchl.)、大丽轮枝菌(VerticilliundahliaeKleb.)、立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKuhn)和拟轮枝镰孢霉(又称根串珠镰孢霉)(Fusariumverticilliodes，异名：FusariummoniliformeSheld)侵染引起。因此，建立病害分子检测方法，通过分子检测查明棉花病株中的病原菌种类，了解不同棉区病害种类及其病害分布，对各地开展针对性的防治，高效控制病害的危害并确保棉花生产持续稳定增产具有重要意义[7]。【前人研究进展】近年来，国内外许多学者针对棉花病害进行了大量研究。王继华[8]采用多重PCR检测香石竹尖孢镰刀菌纯培养和香石竹样品，能特异性地检测出不同生理小种的香石竹尖孢镰刀菌，证实了昆明地区的香石竹尖孢镰刀菌为2号生理小种，并且能检测出接种7 d后的香石竹体内的病原菌。朱有勇等[8]利用棉花黄萎病菌rDNA-IT S区段的碱基编码序列，设计了1对26 bp的特异性引物，并用于棉花黄萎病分子鉴定和分子监测。Encarnacion设计了两对分别检测落叶型和非落叶型棉花黄萎病菌的特异引物，实现了对落叶型和非落叶型棉花黄萎病菌的PCR检测[8]。沈其益[9]报道棉花苗期病害主要有:立枯病、红腐病和黑色根腐病，分别由立枯丝核菌、串珠镰孢霉和根串珠霉(ThielaviopsisbasicolaFerr.)侵染引起。刘萍花等[10]用立枯丝核菌的特异性引物RSF/RSR检测出了苜蓿根腐病的病原为立枯丝核菌。Klittich和Sidhu[11，12]报道了串珠镰孢霉的遗传多样性及较强变异能力,以及所致病害难于防治的现象。Murillo[13]介绍了针对串珠镰孢霉的PCR检测。【本研究切入点】近年来针对上述棉花病害的危害性、病原、品种抗性和病原检测以及病害防治方法的研究较多，而针对这些病害的发生普遍程度的研究较少，对特定棉区的发生分布情况研究鲜有报道。研究新疆东部棉花根茎部病害的种类和分布。【拟解决的关键问题】研究利用已报道的4种引起棉花根茎部病害的病原菌(尖孢镰孢霉、立枯丝核菌、大丽轮枝菌和拟轮枝镰孢霉)的特异性引物对从新疆东部各地采集的病株样品进行特异性引物PCR检测，通过病株中的病原菌检出情况，分析新疆东部棉花主要根茎部病害种类及各病害在新疆东部各地的分布。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

立枯丝核菌菌株RKAWT15-213、RKZP15-113；拟轮枝镰孢霉菌株 FvBYL15-113、FvKYPH15-212和尖孢镰孢霉菌株 FoKBC15-112、FoKAKT15-212为新疆农业大学植物病理实验室提供；大丽轮枝菌菌株 VSW991-33、VBV811-41为新疆农业科学院核技术生物技术研究所提供。用于检测体系验证及病样检测时的阳性菌株。

茄腐镰孢霉Fs159012、葡枝根霉Rs141011、黑曲霉As158011和镰格孢霉Aa141021等为棉花根际土壤中常有的非致病菌，由新疆农业大学植物病理实验室提供。与上述四种病原菌一起用于引物特异性验证。

1.1.2 供试病样

2016年5月，在病害田间调查的同时，按每县3乡，每乡3村，每村3田，每田品字形采样法进行病株采集。先后从新疆东部的哈密市、鄯善县及托克逊县等棉花种植区采集到以村(连)为单位的病株样品22份。

1.1.3 供试培养基及主要试剂

PDA培养基[14]，用于供试菌的保存、培养和扩繁。

2xTaqPCR MasterMix 、ddH2O和DNA Ladder由天根生化科技(北京有限公司)公司生产。

特异性引物选用Murillo I[13]、庞莉[14]、刘萍花[10]和赵宗峰等[15]报道的，经验证无误的4种主要病原菌的4对特异性引物(FUS-F/FUS-R、VDS-F/VDS-R、RSF/RSR、FOF/FOR，由上海生工生物工程技术有限公司合成提供),分别用于拟轮枝镰孢霉、大丽轮枝菌、立枯丝核菌和尖孢镰孢霉的特异性PCR检测。

1.1.4 仪器设备

PCR扩增仪(DL9700，北京东林昌盛生物科技有限公司)、微量高速离心机(TG16-W，长沙湘仪离心机仪器有限公司 )、电泳槽(JY300C，北京君意东方电泳设备有限公司)、旋涡混合器(XH-C，江苏金怡仪器科技有限公司)、凝胶成像系统(G:BOXEF，英国 Syngene公司)。

1.2 方 法

1.2.1 供试菌的DNA的提取

经预培养后的供试菌株采用CTAB方法进行DNA的提取。

1.2.2 退火温度优化和灵敏度测定

参照赵宗峰等[15]报道的反应体系，利用梯度PCR进行退火温度优化。

将各检测目标菌DNA模板稀释至0.5、1、2、5和10 ng /μL，然后用各自的引物进行PCR扩增，根据出现清晰条带的最低模板浓度确定灵敏度。

1.2.3 田间病株混合样品制备及检测

从新疆东部各村(连)采集的多份病样中，随机选取15个病株，洗净、晾干后剪取病部组织，再进一步剪细，制成以村(连)为单位的混合病样(约0.2 g)；经总DNA提取(CTAB法)制成待检测DNA样品。

利用4对特异性引物及优化后的检测体系分别对各待检测DNA样品进行特异性引物PCR检测，记录检测结果。

2 结果与分析

2.1 引物的特异性验证

用4对引物分别对4种主要病原菌和4种棉花根部常有的非致病菌的DNA提取物进行扩增和电泳分析。研究表明，选用引物均具有良好的特异性；其中，大丽轮枝菌的引物只在大丽轮枝菌的DNA模板中扩增出特异性条带，产物片段长度为520 bp，拟轮枝镰孢霉的引物只在拟轮枝镰孢霉的DNA模板中扩增出特异性条带，产物片段长度为1 600 bp,尖孢镰孢霉的引物只在尖孢镰孢霉的DNA模板中扩增出特异性条带，产物片段长度为340 bp，立枯丝核菌的引物只在立枯丝核菌的DNA模板中扩增出特异性条带，产物片段长度为541 bp。图1

注：Vd：大丽轮枝孢菌特异性条带，Fv：拟轮枝镰孢霉特异性条带，Fo：尖孢镰孢霉特异性条带，Rs：立枯丝核菌特异性条带；M:Ladder marker,1-9:各供试菌的DNA模板(1:大丽轮枝菌，2:拟轮枝镰孢霉，3:尖孢镰孢霉，4:立枯丝核菌，5:茄腐镰孢霉，6:葡枝根霉，7:黑曲霉，8:镰格孢霉，9：健康植株)

Note: Vd: Specific Band ofV.Dahliae, Fv: Specific Band ofF.verticilliodes, Fo: Specific Band ofF.oxysporum, Rs: Specific Band ofR.Solani； M: ladder marker,1-9: The antimicrobial mo of DNA ( 1:V.Dahliae, 2:F.verticilliodes, 3:F.oxysporum, 4:R.Solani, 5:Fusarium.solani， 6:Rhizopusstolonifer, 7:Aspergillusniger, 8:Fusariumgraminearum, 9:Healthyplant)

图1 4对引物的特异性PCR扩增条带
Fig.1 Bands of 4 pairs of primers for specific PCR amplification

2.2 最佳退火温度及检测灵敏度

研究表明，4对特异性引物的最佳退火温度不同，分别为：尖孢镰孢霉54℃，立枯丝核菌59℃，大丽轮枝菌56℃，拟轮枝镰孢霉60℃。

在相同反应体系[16](总体积25 μL，含ddH2O 10 μL，上引物1 μL，下引物1 μL，模板DNA 1 μL，2xTaqPCR MasterMix 13 μL)及各自的最佳退火温度下，4对引物对4种病原菌的检测灵敏度均能达到0.5 ng /μL。在此体系下，当4种病原菌DNA模板浓度为0.5 ng /μL以上时，均可分别扩增出各自的特异性条带。图2

2.3 田间病株中的病原菌检测情况

利用4对引物(RSF/RSR、FOF/FOR、VDS-F/VDS-R、FUS-F/FUS-R)对采集的22份新疆东部棉花根部混合病样进行的分子检测结果显示:在根部病样中较普遍地检测到立枯丝核菌、尖孢镰孢霉和大丽轮枝菌3种病原菌的清晰条带，各种病原菌在不同市、县的检出率在37.5%～100%，而拟轮枝镰孢霉在22份混合样中检出率为0。表1，图3

尖孢镰孢霉、立枯丝核菌和大丽轮枝菌普遍存在于新疆东部棉花根部病样中，是新疆东部部分地区的棉花根部病害的主要病原菌；也说明新疆东部棉区主要棉花根部病害为枯萎病、立枯病和黄萎病。

2.4 主要病原菌及所致病害分布

对不同病原菌在不同市、县的检出率统计结果说明不同病原菌在新疆东部棉区的检出率不同，其中尖孢镰孢霉检出率最高(50%～100%)，立枯丝核菌次之(50%～75%)，大丽轮枝菌检出率相对较低(37.5%～50%)；说明新疆东部棉区棉花根茎部病害中由尖孢镰孢霉引起的枯萎病发生分布最为普遍，仅在极少数病样中未检测出，由立枯丝核菌引起的立枯病发生分布的普遍性略次于枯萎病，约在60%以上的病样中检出，由大丽轮枝菌引起的黄萎病的分布相对较少，约在42%病样中检出。

从不同、县市病样检出情况来看，病害分布情况也略有不同，哈密市及周边团场病害检出率最高，其中枯萎病检出率达100%；鄯善县总的病害检出率与哈密市相近，但枯萎病检出率相对较低，而立枯病检出率相对较高；而托克逊县总的病害检出率最低，但3种病害的检出率相当，均为50%，其中黄萎病的检出率较哈密市和鄯善县高，说明该县3种棉花根茎部病害的发生分布比较均衡，但该县黄萎病的发生分布在新疆东部相对较高。表1，图3

注：M: ladder marker，1～2: 拟轮枝镰孢霉+FUS-F/FUS-R，3～4: 立枯丝核菌+RSF/RSR，5～6:尖孢镰孢霉+FOF/FOR，7～8:大丽轮枝菌+VDS-F/VDS-R，9：纯水

Note: M:laddermarker, 1-2:F.verticilliodes+FUS-F/FUS-R, 3-4:R.solani,+RSF/RS, 5-6:F.oxysporum+FOF/FOR, 7-8:V.dahliae+ VDS-F/VDS-R, 9: Purified water

图2 4种病原菌在DNA模板浓度为0.5 ng /μL时PCR扩增条带
Fig.2 The PCR amplification bands in the DNA template concentration of 0.5 ng/μL

注：Vd：大丽轮枝孢菌特异性条带，Rs：立枯丝核菌特异性条带，Fv：拟轮枝镰孢霉特异性条带, Fo：尖孢镰孢霉特异性条带，M: Ladder marker, CK:阳性对照，1～22:各乡病株根部混合样品

Note: Vd: Specific Bands ofV.Dahliae,Rs: Specific Bands ofR.Solani, Fv: Specific Band ofF.verticilliodes, Fo:Specific Bands ofF.oxysporum, M: Ladder marker， CK: positive control ，1-22: Samples the root of each country plant

图3 新疆东部棉花根部病样中各病原菌检测结果
Fig.3 The detection results of various pathogens in cotton root disease in Eastern Xinjiang

3 讨 论

基于特异性引物PCR进行病原菌分子检测技术已经比较成熟、敏感度高、特异性强、重复性好以及能快速和直接确定侵入的多种病原菌，并可由此分析其病原菌种类及优势致病种群。研究是将分子检测方法用于病害检测及分布调查的一次有益偿试，研究结果在一定程度上反映了新疆东部棉花根茎部病害主要种类及各种病害的分布情况，对于各地开展针对性的病害防治及农药减施技术的研究有一定的参考意义。但由于采样地点及病样数量的局限性(如未涉及吐鲁番市的少量棉田)，以及检测技术应用中的缺陷，可能不足以反映整个新疆东部棉花根茎部病害的种类及分布的全貌，也不排除个别地域有未检测到的主要根茎部病害(如红腐病)的发生。

4 结 论

4种主要病原菌的特异性引物PCR检测结果表明：新疆东部各地棉花根茎部主要病害有3种，分别为枯萎病、立枯病和黄萎病。其中枯萎病的发生普遍率最高，立枯病次之，黄萎病的发生普遍率比较低。

各病原菌在22个以村为单位的混合病样中的检出率有明显的差异。其中尖孢镰孢霉检出率最高(86.36%)，立枯丝核菌检出率次之(63.64%)，大轮枝菌检出率较低(40.91%)，拟轮枝镰孢霉的检出率0%。说明新疆东部棉花枯萎病的发生最为普遍，立枯丝核菌次之，黄萎病发生的普遍率相对较低，红腐病在各地未检出，说明红腐病在新疆东部无发生或发生非常少。新疆东部各市、县棉花根茎部病害发生情况与新疆东部整体发生情况有相近的趋势。3种病害发生的普遍程度多以枯萎病、立枯病、黄萎病为序。仅托克逊县的病害发生率较低，3种病害发生分布较为均衡。

参考文献(References)

[1] 戴小枫,郭予元. 棉铃虫的抗药性与治理[M]. 北京:中国农业出版社,1995.

DAI Xiao-feng，GUO Yu-yuan.(1995).ResistanceandtreatmentofCottonbollworm[M]. Beijing: China Agriculture Press. (in Chinese)

[2] 陈其煐. 我国棉花病害发生情况及防治进展[J]. 农药,1996,(3):6-9,11.

CHEN Qi-ying.(1996). Cotton diseases and progresses of their Control in China [J].Agrochemicals,(3):6-9,11.(in Chinese)

[3] 郭淑丽. 棉花枯萎病和黄萎病的综合防治[J]. 科学种养,2008,(9):28.

GUO Shu-li.(2008). Comprehensive control of cotton wilt and verticillium wilt [J].Scientificfarming, (9):28.(in Chinese)

[4] 孜乃提古丽·阿不都热西提. 棉花棉苗立枯病的发生及防治[J]. 现代农业科技,2009,(11):131-132.

Zinaitiguli·Abudourexiti.(2009). Occurrence and prevention of the Rhizoctonia damping-off of cotton [J].ModernAgriculturalScienceandTechnology，(11):131-132. (in Chinese)

[5] 王今. 棉花病害症状识别与化学用药[J]. 农技服务,2011,(7):990-991.

WANG Jin .(2011). Symptom identification and chemical medicine of cotton disease [J].AgriculturalTechnologyService, (7):990-991. (in Chinese)

[6] 潘月敏. 棉花红腐病菌生理生化及有效复配剂筛选研究[D]. 合肥: 安徽农业大学硕士学位论文,2005.

PAN Yue-min. (2005).OnphysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofFusariummoniliformeandscreeningforeffectivemixedpreparations[D]. Master Thesis. Anhui Agricultural University, Hefei.(in Chinese)

[7] 周小燕. 棉花病害诊断专家系统研究[D]. 北京：中国农业大学硕士学位论文,2005.

ZHOU Xiao-yan. (2005).Anexpertsystemforcottondiseasesdiagnosis[D].C Master Thesis.hina Agricultural University， Beijing.(in Chinese)

[8] 陈文霞. 新疆棉花枯萎病菌遗传多样性研究及其分子检测[D]. 石河子：石河子大学硕士学位论文,2008.

CHEN Wen-xia.(2008).StudiesongeneticdiversityandMoleculardetectionofFusariumoxysporumf.sp.hasinfectuminXinjiang[D]. Master Thesis. Shihezi University, Shihezi.(in Chinese)

[9] 沈其益. 棉花病害一基础研究与防治[M]. 北京:科学出版社，1992.

SHEN Qi-yi. (1992).Cottondiseases：Basicresearchandcontrolling[M]. Beijing: Science Press.(in Chinese)

[10] 刘萍花,方敦煌,吴祖建. 应用多重PCR检测烟草黑胫病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌及立枯病[J].福建农林大学学报(自然科学版),2015,(4):345-349.

LIU Peng-hua, FANG Dun-huang, WU Zu-jian.(2015). Simultaneous detection of Phytophthora uicotiauae，Thielaviois basicola，Pythium aphauidermatum and Rhizoctouia solani infected tobacco by multiplex PCR [J].JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(Natural Science Edition),(4):345-349.(in Chinese)

[11] Klittich, C. J. R., & Leslie, J. F. (1989). Chlorate-resistant, nitrate-utilizing (crn) mutants of fusarium moniliforme (gibberella fujikuroi).Microbiology,135(3): 721-727.

[12] Sidhu, G. S. (1984). Genetics of gibberella fujikuroi v. spore killer alleles in g. fujikuroi.JournalofHeredity, 75(3):237-238.

[13] Murillo, I., Cavallarin, L., & Segundo, B. S. (1998). The development of a rapid pcr assay for detection of fusarium moniliforme.EuropeanJournalofPlantPathology, 104(3): 301-311.

[14] 庞莉. 棉花黄萎病菌的快速分子检测技术研究[D]. 北京：中国农业科学院硕士学位论文,2015.

PANG Li. (2015).StudyonrapidmoleculardetectiontechniqueofVerticilliumdahliaeofCotton[D]. Master Thesis. Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing.(in Chinese)

[15] 赵宗峰.新疆呼图壁县种用苜蓿主要真菌病害及其病原菌初步研究[D]. 乌鲁木齐: 新疆农业大学硕士学位论文,2011.

ZHAO Zong-feng.(2011).PreliminarystudyonmajorfungaldiseasesandpathogensofalfalfainHutubiCountryofXinjiang[D]. Master Thesis. Xinjiang Agricultural University, Urumqi.(in Chinese)

SpeciesandDistributionofCottonRootandStemDiseasesinEasternXinjiangBasedonMolecularDetection

Mayinuer Mijiti, Zumina, Sajida Aizizi, GUO Qing -yuan

(XinjiangAgriculturalUniversity/CollegeofAgronomy/KeyLaboratoryoftheAgricultureandForestryPestMonitoringandSafetyControlofCollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

ObjectiveClarifying species and distribution of cotton root and stem diseases in eastern Xinjiang can provide a basis for effective prevention and control of such diseases in the local area.MethodThe reported specific primers of the 4 species pathogens (Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, verticillium dahliae and Fusarium verticilliodes) which cause the root and stem disease of cotton are used for the specific verification, and carrying out PCR detection for the mixed disease samples of the collected according to different villages (townships) from the cotton areas in Eastern Xinjiang.ResultIn the tested system with sensitivity of 0.5 ng/μL, 3 species of 4 pathogenic bacteria were detected from the 22 mixed samples of cotton infected plants from the Eastern Xinjiang. They were respectivelyFusariumoxysporum,Rhizoctoniasolaniandverticilliumdahliae；Among them,Fusariumoxysporumhad the highest detection rate，Rhizoctoniasolaniwas the second,V.dahliaedad the lower detection rate. But, the detection rate ofFusariumverticilliodeswas 0% in the 22 mixed samples.ConclusionThe detection results indicated that the Fusarium wilt，Rhizoctonia damping-off and Verticillium yellow wilt were the main root and stem diseases of cotton in Eastern Xinjiang; Among which, Fusarium wilt is the most common one, followed by Rhizoctonia damping-off, and the incidence of Verticillium wilt is relatively low. In Eastern Xinjiang, red rot has not occurred or distribute very little.

cotton; root and stem disease; PCR detection; distribution of disease

Supported by: Special projects of Ministry of Agriculture “Research and integration of crop root rot disease control technology”(201503112)；Key research and development plans of the xinjiang uygur autonomous region “Development of new technology and product for control Main diseases and pests and reduce Pesticide and increase effect in cotton field”(2016B01001)

GUO Qing-yuan(1962-)，Sichuan people, Professor of college of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, working on plant pathology，(E-mail)guoqingyuan3009@sina.com

S435.621

A

1001-4330(2017)11-2046-08

2017-11-01

农业部专项“作物根腐类病害防控技术研究与集成”(201503112)；新疆维吾尔自治区重点研发计划“棉田主要病虫防治及农药减施增效新技术与产品研发”(2016B01001)

马依努尔·米吉提(1991-)，新疆人，硕士研究生，研究方向为植物病理，(E-mail)2517884144@qq.com

郭庆元(1962-)，四川人，教授，硕士生导师，研究方向为植物病理，(E-mail)guoqingyuan3009@sina.com