酶催化酸性油连续法制备脂肪酸乙酯

张永民，张静，宋利春 编译

(1.江南大学；2神华亿利能源有限责任公司电厂)

酶催化酸性油连续法制备脂肪酸乙酯

张永民1，张静2，宋利春2编译

(1.江南大学；2神华亿利能源有限责任公司电厂)

采用从嗜热真菌（Thermomyces lanuginosus）中提取的Lipozyme TL IM（Novozymes，Seoul, Korea）作为固定化脂肪酶，考察了其催化酸性油与乙醇反应制备脂肪酸乙酯的合成工艺。其中原料酸性油主要是由米糠油精制过程中产生的副产物（皂脚）的酸化获得。研究了水含量、反应温度和物料比对该工艺的影响，并对固定化脂肪酶重复利用过程中Lipozyme TL IM的相对活性进行了评价。研究结果表明：反应物中水含量对酯的收率影响很大，最佳含水量为4%；最佳反应温度是20℃，酸性油/乙醇的最佳物料比为1:4。在最佳工艺条件下，最大收率为92%，产物组成为92%脂肪酸乙酯、3%脂肪酸和5%酰基甘油。通过间歇性的乙醇洗涤工艺可将反应生成的甘油去除，并且脂肪酶在循环使用了27次后依然可以保持82%以上的相对活性。以平均4 h滞留时间计算，Lipozyme TL IM在不进行乙醇洗涤和进行乙醇洗涤两种工艺中的半衰期分别为39和45次循环。

酸性油；生物柴油；连续反应釜；脂肪酸乙酯；嗜热菌脂肪酶；酯交换

随着人们对传统石油基燃料带来的一系列环境问题的担忧，生物柴油作为化石燃料的替代品，日益引起人们的广泛关注。生物柴油不仅是可重复利用的、生物降解的和相对无毒的，而且排放物中含有的悬浮颗粒和温室气体（如CO、CO2、SOx）也很低。同时，生物柴油具有良好的润滑性能，可以显著提高发动机效率，延长使用寿命。此外，生物柴油不会产生易燃易爆气体，闪点高。因此，相对于传统柴油，生物柴油的运输、使用和储存更加安全。

生物柴油主要由脂肪酸单烷酯组成。这些脂肪酸可以来自于植物油，也可以来自于动物脂肪。通过简单的脂肪酸与短链醇间的酯交换反应即可制得生物柴油。

酯交换反应既可通过化学催化实现，也可通过酶催化实现。虽然利用化学催化剂（氢氧化钠或氢氧化钾）已经成功制备了生物柴油，但是该工艺却有无法回避的缺点：副产物甘油难回收和反应结束后必须去除催化剂。相比之下，酶法制生物柴油可以很好地避免这些问题。更为重要的是以脂肪酶作为催化剂，反应条件可以更加温和，允许水的存在，避免皂的生成，进而提高反应产率。

皂脚是油类精炼过程中的主要副产物，产生于工艺中的中和阶段。对皂脚简单酸化处理，即可得到酸性油。由于米糠油中脂肪酶的高水解活性，使得在米糠油的精炼过程中产生了大量皂脚。因此，米糠皂脚被认为是生物柴油工业的一种理想的低价原料来源。

基于填充床反应器（PBR）的连续操作工艺是一种最适合酶催化脂肪酸反应的工业技术。该工艺的最大优势就是反应可以在非常短的时间内达到平衡。其次，该工艺非常适宜规模化放大生产，可以有效地将反应产物与固定化催化剂分离，并且固定化酶的稳定性已经得到极大改进，也为该工艺的连续循环操作贴上了低成本的标签。

到目前为止，Novozym 435、Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM等商品化固定化脂肪酶已在填充床反应器中被应用于各种酶催化反应。其中，提取自嗜热菌的商品酶Lipozyme TL IM是最廉价的固定化酶之一，它被广泛应用于生物柴油工业生产。

本文研究了Lipozyme TL IM催化酸性油与乙醇在填充床反应器中的酯交换反应。分别考察了初始水含量、反应温度和物料比对酶催化酯交换工艺的影响，通过对实验数据的分析确立最佳工艺参数。在最佳工艺条件下，考察了Lipozyme TL IM的相对活性和甘油对Lipozyme TL IM相对活性的影响。

1 实验

1.1 试剂

米糠油皂脚（CJ LTE.，Seoul, Korea），固定化嗜热菌脂肪酶（Lipozyme TL IM，Novozymes，Korea），酶的活性为180,875 U/mg，其他试剂均为分析纯。

1.2 酸性油的制备

在配有RZR 2051叶轮混合器（Heidolph,Schwabach, Germany）的3000 mL三口烧瓶内，依次添加100 g米糠油皂脚，300 mL异丙醇，300 mL正己烷和100 mL去离子水。室温搅拌，边搅拌边滴加50 wt%硫酸，直至反应体系的pH降至2～3左右。继续搅拌1 h后反应结束，静置。溶液分为上下两层，用分液漏斗将含有盐水、异丙醇和其它水溶性物质的下层放出，将含有酸性油和正己烷的上层用热水反复洗涤，直至水相pH为中性时结束。油相经无水硫酸钠干燥后通过减压蒸馏去除溶剂。所得酸性油组成（质量分数）为：（53.7 ±1.3）%脂肪酸，（2.4 ± 0.1）%单甘酯，（9.1 ±1.2）%双甘酯，（28.8 ± 0.5）%三甘酯和（6.0 ±0.6）%其他物质。酸性油中的脂肪酸主要为棕榈酸（21.6%），硬脂酸（1.6%），油酸（38.8%），亚油酸（36.5%）和亚麻酸（1.5%）。100 g皂脚大约可获得54 g酸性油。

1.3 Lipozyme TL IM催化酯交换反应

Lipozyme TL IM催化酸性油与乙醇间的酯交换反应在如图1a 所示的小型填充床反应器中进行。该反应器由长5.1 cm的不锈钢管（0.48 cm I.D.）构成。反应物为乙醇和由米糠油皂脚制得的酸性油。固定化Lipozyme TL IM堆积在填充床反应器中。由注射泵(Model 200; KD Scientific, New Hope, Pa., U.S.A.)将反应物连续不断地从50 mL 玻璃注射器内输送到反应器中。整个反应器浸没在水浴中，并用循环水和温度控制器（Lauda, Lauda-Königshofen, Germany）保持温度的恒定。反应物从底部进入反应器，随着液面上升将空气驱赶出去。每次实验前都应对反应器进行预处理以确保热平衡和空气被驱赶干净，然后收集样品。

为了获得最佳的工艺条件，分别研究了水含量、反应温度和脂肪酸与乙醇物料比在0～6 %，0～40 ℃和1:3～1:6范围变化时酯交换反应的结果。

图1 Lipozyme TL IM 催化酯交换反应使用的填充床反应器（PBR）工艺图

1.4 酶的重复利用

以循环次数作为指标对经过不同程度使用后酶的相对活性进行了评价，进而探究了连续操作工艺下残留的甘油对Lipozyme TL IM催化酯交换反应的影响。实验装置如图1b所示。实验在最佳工艺条件下进行，即4%含水量，20℃，脂肪酸与乙醇物料比为1:4，反应物在反应器内滞留时间为4h。采用两种不同的填充床工艺对比研究了副产物甘油对酶的抑制作用。第一种工艺对反应器中的甘油不作任何处理，作为控制对照工艺；第二种工艺利用改进的装置增加洗涤步骤，即利用乙醇间歇性地清洗反应器和Lipozyme TL IM固体颗粒，从而将包埋的或吸附的甘油从反应器中去除。对于实验12、24、36和48，分别用10 mL乙醇来去除甘油。

1.5 分析方法

反应过程中每隔一段时间取出10 mg样品，将其溶解在1 mL氯仿中，然后采用配有离子火焰检测器的气相色谱（Model 3800; Varian, Palo Alto, CA）进行分析。起始时柱温为120℃，3 min后以20℃/min的速率升温至370℃，保持5 min。所用气体为氦气，流速1.5 mL/min。进样器和检测器温度均保持在370℃。酰基甘油、脂肪酸乙酯和游离脂肪酸的量通过气相色谱测定。由于游离脂肪酸和脂肪酸乙酯无法通过气相色谱实现分离，游离脂肪酸的量可通过酸碱中和滴定测量，用0.1 摩尔当量的KOH滴定脂肪酸，以碱性蓝（Merck Chemical, Darmstadt, Germany）作为指示剂。脂肪酸乙酯的产率可通过下式计算获得

a为反应物中脂肪酸乙酯的质量，b是反应物中脂肪酸乙酯、游离脂肪酸和酰基甘油的总质量。

反应物中的水含量通过Karl-Fisher水分测量仪（Model 870 KF Titrino plus; Metrohm AG; Herisau,Switzerland）监测。

1.6 拟合模型

按照固定化酶失活模型分别对对照工艺和改进工艺中的生物催化剂的半衰期进行拟合。为了确定每一个模型的相关性系数，对固定化酶的测量半衰期与估算半衰期的偏差进行了最小化处理。根据下面的残余活性方程计算酶的估算半衰期：

其中k是反应速率常数（1/time），t是反应物滞留时间（h）。

2 结果与讨论

2.1 初始水含量的影响

长久以来，水含量一直被认为是维持酶活性的重要因素。少量水的存在对维持酶的活性是十分有利的；但是，过量的水往往会导致反应的平衡偏离酯交换，而倾向于水解。每一种酶都有各自维持最佳活性所需要的最佳水含量，这与每一种酶的特性是密不可分的。当酶被固定化时，载体对水的亲和力也将影响酶的催化活性。因此，最佳水含量与所用的载体也是密切相关的。嗜热菌脂肪酶分解脂肪的反应在接近无水的条件下的反应速率是非常低的。相比较而言，提取自Candida antarctica的脂肪酶(Novozym 435)却在水含量非常低的情况下展现出很高的催化活性。

图2 初始的水含量对经过Lipozyme TL IM 催化酸性油与乙醇的酯交换反应制备脂肪酸乙酯的影响

由于水含量会对酶的几何结构和立体构型产生影响，因此，以酶作催化剂的填充床反应器中水分的含量通常对酶的稳定性、活性和选择性产生显著影响。如何准确测量水分含量就成为了酶催化用填充床反应器设计中必须解决的问题之一。图2显示了初始的水含量对经过Lipozyme TL IM催化酸性油与乙醇的酯交换反应制备脂肪酸乙酯的影响。水含量为以反应物为基准的质量百分数，考察范围为0～6 %，其他反应条件保持不变（30℃，酸性油/乙醇=1:5）。由图2可知，在实验的反应时间内，脂肪酸乙酯的产率随着水含量从0增加4%而逐渐增大。尽管如此，当水含量超过4%以后，脂肪酸乙酯的产率却基本保持不变。水含量为0时，脂肪酸乙酯的最大产率只有约20%。这主要是因为水含量的增大将提高酶催化水解反应的速率，并可能影响了醇解反应的酶的活性。在酶催化三油酸甘油酯的醇解实验中也发现了相似的结果。当用嗜热菌脂肪酶作为催化剂时，醇解反应在无水条件下的反应极其缓慢。这是因为脂肪酶有非常大的限制区域和界面活化作用，与较大的构型变化密切相关。

当水含量为4%时，脂肪酸乙酯的产率在4 h内可以达到最大，约90%。因此，最佳水含量为4%。

2.2 温度的影响

由于酶的活性和选择性对温度非常敏感，因此，研究温度对酶催化反应的影响十分必要。虽然温度过高会导致酶失活，但是升高温度通常会带来一个加速效应。本实验固定水含量为4 %和酸性油与乙醇的摩尔比为1:5，考察了温度在0～40℃范围内变化时，对经Lipozyme TL IM催化酸性油与乙醇酯交换反应制备脂肪酸乙酯的影响，结果见图3。由图3可知，随着反应温度从0升至30℃，脂肪酸乙酯的产率不断增大。继续升高温度，脂肪酸乙酯的产率不再增大，反而快速下降。特别是40℃时，脂肪酸乙酯的产率在反应的前2 h内持续增大，但是随后开始下降。这可能是由于酶的醇解活性在40℃时丧失造成的。尽管Lipozyme TL IM被认为在酸解和酯交换反应中是耐高温的，但是在乙醇存在下Lipozyme TL IM在40℃以上通常会发生不可逆变性。有文献报道Lipozyme TL催化天然棕榈油与甲醇酯交换反应时，脂肪酸酯的产率会随着温度的升高而下降，特别是当温度高于40℃以后。Dizge等也报道了Lipozyme TL催化菜籽油与甲醇酯交换反应时，随着温度从40℃升高至70℃脂肪酸酯的产率将从85.8%降低至21.1%。这通常被归因于酶在温度超过40℃后的不可逆变性。

由于脂肪酸乙酯在20℃和30℃时所能达到的最大产率没有明显差异，所以，从节能的角度考虑，实验选择20℃作为反应温度。

图3 湿度对酶催化反应中脂肪酸乙酯的产率的影响

2.3 物料配比的影响

固定水含量为4 %和反应温度为20℃，实验考察了酸性油与乙醇的摩尔比在1:3 ～1:6范围内变化时，对经Lipozyme TL IM催化酸性油与乙醇酯交换反应制备脂肪酸乙酯的影响，结果见图4。当摩尔比为1:3时，脂肪酸乙酯的产率在反应进行4 h后达到平衡，大约78%。此时，反应速率比摩尔比为1:4和1:6时慢。当摩尔比为1:4和1:6时，反应产率几乎一致。Corrêa等认为酯交换反应产率的下降是由于过量醇的存在，导致酶的活性降低所引起的。因此，在高浓度醇存在下，酶活性和酯交换反应产率的下降很好地反映了醇对水分子与固定化酶的构想之间相互作用的干扰，从而破坏了酶的活性和稳定性。根据以上实验结果，选择酸性油与乙醇的摩尔比为1:4作为最佳物料比。此时，脂肪酸乙酯的产率为92%，其余为3%脂肪酸和5%酰基甘油。

根据以往的研究可知，Lipozyme TL IM是一种1,3-配位的脂肪酶，它可以水解三酰甘油中1位和3位的酯键，故理论上的最达产率为66.67 %。但是我们却获得92%的产率，这是因为酸性油中含有大量游离脂肪酸（约54%），它们可以完全转化为脂肪酸乙酯。

图4 酸性油与乙醇的摩尔比对于经Lipozyme TL IM 催化酸性油与乙醇酯交换反应制备脂肪酸乙酯的影响

2.4 固定化酶的重复利用

固定化酶的最大优势就是其稳定性和可重复利用性。固定化酶的使用寿命已然成为评价工艺经济成本的重要指标。实验考察了最佳工艺条件（水含量为4%，反应温度为20℃，酸性油与乙醇的摩尔比为1:4，反应物滞留时间4 h）下，Lipozyme TL IM在填充床反应器中进行连续化酯交换反应过程的稳定性，并且对比研究了在两种不同的填充床反应工艺中甘油的抑制作用，结果见图5。第一个工艺作为对照体系，对反应中生成的甘油不作任何处理。相比之下，第二个工艺中加入一个间歇性洗涤操作单元。每循环生产12次(48 h)后，用乙醇将甘油除去。在这两种工艺中，固定化脂肪酶均保持了其对脂肪酸乙酯的高催化活性，即使进行了18次循环后。但是，如果进一步增大循环次数，从18次增加到27次，控制对照工艺中酶的相对活性降低较大，为66%；然而，增加了乙醇冲洗操作的工艺中酶的活性降低较小，依然可以达到82%。控制对照工艺中，Lipozyme TL IM的半衰期为39次循环，而乙醇冲洗工艺中Lipozyme TL IM的半衰期为45次循环。通过酶失活模型估算得到的在两种工艺中Lipozyme TL IM半衰期分别为40.5次循环和45次循环。二者的吻合度非常好。

当酶被连续使用后，它的相对活性会有所降低。作为三酰甘油与乙醇酯交换反应的产物，甘油是其中最重要的原因所在，它已经被确认是一种酶抑制剂。Salis等人对此给出了可能的抑制作用机理。首先，甘油在酶表面的吸附导致了酶中所含水的活度降低。其次，甘油在酶表面形成的吸附层阻碍了疏水反应物向酶的活性位点的扩散。Li等也报道了在无溶剂法酶催化制备脂肪酸乙酯工艺中，大量甘油被吸附在固定化脂肪酶的表面，导致了酶的使用寿命的缩短。Watanabe等认为甘油可以扰乱反应物向酶的扩散，从而导致反应速率随着未反应醇浓度的增大而降低。实验结果也证实了酯交换反应中生成的甘油抑制了Lipozyme TL IM的反应活性。尽管如此，用乙醇对生物催化剂进行间歇性冲洗可以从填充床反应器中有效地去除甘油，从而提高酶的使用寿命。

图5 Lipozyme TL IM在填充床反应器中进行催化酯交换反应过程的相对活性

3 结论

以Lipozyme TL IM作为催化剂，在填充床反应器中实现了从米糠油皂脚酸化制得的酸性油和乙醇的酯交换反应制备脂肪酸乙酯的高效合成。水含量、反应温度和物料比对脂肪酸乙酯的产率有显著影响。通过乙醇冲洗可以明显提高脂肪酶的相对活性。

（译自《J Am Oil Chem Soc》19 January 2016）

Synthesis of Fatty Acid EthyI Ester from Acid OiI in a Continuous Reactor via an Enzymatic Transesterification

Nakyung Choi1,2· Yangha Kim3· Jeom‑Sig Lee4· Jieun Kwak4· Junsoo Lee5·In‑Hwan Kim1,2

Synthesis of a fatty acid ethyl ester via the lipase-catalyzed transesterification of acid oil and ethanol was investigated in a continuous reactor. Lipozyme TL IM was employed as the immobilized lipase. This immobilized lipase derived from Thermomyces lanuginosus was purchased from Novozymes (Seoul, Korea). The acid oil was prepared by the acidification of soapstock formed as a byproduct during the refining of rice bran oil. The parameters investigated were water content,temperature, and molar ratio of substrates. The relative activity of Lipozyme TL IM was assessed during the repeated use of the immobilized lipase. The water content of the substrate had a considerable effect on the yield and the optimum water content was 4 %. The optimum temperature and molar ratio of acid oil to ethanol were 20 °C and 1:4, respectively. The maximum yield of approximately 92 % was achieved under the optimum conditions. The corresponding compositions were 92 % fatty acid ethyl esters, 3 % fatty acids, and 5 % acylglycerols. When glycerol formed during the reaction was removed by intermittent washing with ethanol, the relative activity of lipase was maintained over 82 % for a total usage of 27 cycles. For a mean residence time of 4 h, the half-life times of Lipozyme TL IM on the control (unwashed) and treatment (washed) were 39 and 45 cycles, respectively.

acid oil; biodiesel; continuous reactor; fatty acid ethyl ester; thermomyces lanuginosus lipase; transesterification