苯并咪唑混合离子液体在孔雀石绿及结晶紫检测中的应用

吴永宝，洪 霞，钱滢文，高志莹，刘 琦，周鑫魁*

（1.甘肃省商业科技研究所，甘肃 兰州 730010；2.甘肃中商食品质量检验检测有限公司，甘肃 兰州 730010）

苯并咪唑混合离子液体在孔雀石绿及结晶紫检测中的应用

吴永宝1，2，洪 霞1，2，钱滢文1，2，高志莹1，2，刘 琦1，2，周鑫魁1，2*

（1.甘肃省商业科技研究所，甘肃 兰州 730010；2.甘肃中商食品质量检验检测有限公司，甘肃 兰州 730010）

以1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐作为萃取试剂，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐作为辅助溶剂及载体，按照1∶9（V/V）混合，得到混合离子液体。利用混合离子液体液-液分散萃取养殖水及水产品中的孔雀石绿及结晶紫，并优化萃取条件。通过高效液相色谱-荧光检测器检测孔雀石绿及结晶紫的含量。结果表明，选择混合型离子液体进行吸附，以乙腈为分散剂，采用液-液分散萃取，在pH值为4～8的环境下对目标物进行萃取，效果良好。孔雀石绿和结晶紫回收率分别为90.16%～93.73%和90.25%～93.88%，相对标准偏差（RSD）分别为1.42%和1.63%。表明所建立的样品前处理方法及检测方法准确度高，可用于孔雀石绿及结晶紫的检测。

苯并咪唑混合离子液体；孔雀石绿；结晶紫；液-液分散萃取；高效液相色谱

孔雀石绿、结晶紫是一种N-甲基三苯甲烷类染料，由于其抗菌效果好、价格便宜、容易获得，曾被广泛用于防治水产动物的真菌病、细菌病和寄生虫病等。由于孔雀石绿、结晶紫在生物体内的代谢产物分别为隐色孔雀石绿、隐色结晶紫，其具有高毒性、高致癌、高致畸、致突变等副作用[1-2]。我国于2002年5月将孔雀石绿、结晶紫列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。目前，检测孔雀石绿的方法有免疫法[3-4]、表面增强拉曼光谱法（surface enhanced raman scattering，SERS）、紫外光谱法、荧光光谱法[5]、量子点荧光淬灭法[6]、液相色谱-质谱联用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[7]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8-9]、电化学发光分子印迹法[10]等。液相色谱法和液相色谱-质谱串联法自动化程度高，仪器重复性好，被广泛应用。但实际试验过程中需要对样品进行比较繁琐的样品前处理工作，实验过程可能出现二氯甲烷层忽上忽下[11]，易乳化等现象，耗时长，稳定性差，回收率不高等。因此很有必要建立一种简单、快捷、稳定、回收率高的样品前处理提取方法。

根据阴离子种类不同，离子液体可以表现出亲水性和憎水性；而根据阳离子结构不同，可以表现出不同程度的共轭性或根据阳离子支链镶嵌官能团不同，被广泛应用在分离、萃取、合成、催化等方面[12]。其中烷基咪唑类离子液体常被用于萃取和富集苯及苯的衍生物等[13-14]。但是咪唑环共轭程度较低，对共轭结构的物质吸附效果不够理想。然而苯并咪唑类离子液体具有很高的共轭性，可以吸附具有共轭结构的有机分子[15-16]。所以考虑利用苯并咪唑类离子液体富集萃取样品中的孔雀石绿及结晶紫，然而，苯并咪唑类离子液体室温下呈白色固体的性状，无法有效地提取样品中的目标物。因此，选择将苯并咪唑离子液体和咪唑类离子液体按一定比例混合使用，既可满足液体的流动性，也可满足对目标化合物的吸附性。

混合离子液体对目标物吸附性的表现方式也极其重要，常用液-液萃取、固相萃取等。液-液分散萃取因其所需溶剂量小，萃取速度快，富集倍数高，操作简单和环境友好等优点[17-18]，已成为一种新型且具有潜力的分离富集手段。本研究在此基础上建立了混合离子液-液分散萃取法萃取样品中孔雀石绿及结晶紫的方法，并对液-液分散萃取条件进行了优化，以期建立一种对孔雀石绿及结晶紫操作简便、稳定性好、回收率更高的检测方法，并为混合离子液体在液-液分散萃取技术研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

孔雀石绿标准品（纯度99.5%）、结晶紫标准品（纯度99.7%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；硼氢化钾（分析纯）：上海中秦化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：北京百灵威科技有限公司；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-苄基-3-乙基苯并咪唑溴化盐：按参考文献[15]本实验室自主合成；六氟磷酸盐（分析纯）：阿拉丁试剂上海有限公司；鱼、虾、养殖水样品：兰州市区综合市场、水产市场及超市。

1.2 仪器与设备

RX-II离心机：天美中国科学仪器有限公司；20A高效液相色谱仪：日本岛津企业管理中国有限公司；XB220电子天平：普利赛斯国际贸易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶剂的配制

称取1-苄基-3-乙基苯并咪唑溴化盐20 g溶于水中，边搅拌边滴加饱和六氟磷酸盐水溶液，出现白色絮状沉淀，滴加至不产生沉淀，即停止滴加，抽滤，并用水多次洗涤滤饼，70℃真空干燥，得到白色粉末状固体，即为1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐。分别称取1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐5.00 g和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐溶液45.00 mL，置于鸡心瓶中，加入100 mL乙腈，溶解1-苄基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸盐和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐，70℃旋转蒸发60 min，去除乙腈，得到无色透明黏稠的液体，即为混合离子液体。称取0.54 g硼氢化钾，溶于50 mL超纯水中，得到还原剂，现用现配。

1.3.2 样品前处理方法[7-8]

待检测样品制备：鱼类样品，去除鱼鳞，取背部鱼肉在匀浆机中打成肉泥；虾类样品，去除虾壳和虾头，取所有虾肉在匀浆机中打成肉泥；养殖水样可直接称取。

对制备好的样品进行液-液分散萃取。称取5.00 g待检测样品于离心管中，按顺序加入20mL乙腈作为混合离子液体液-液分散萃取的分散剂，1.00mL混合离子液体和10 mL还原剂，10000r/min均质1min，超声提取5min，10000r/min离心3min，得上清液和沉淀物，将该上清液转入鸡心瓶中，用5 mL乙腈洗涤沉淀物，将洗涤后的溶液合并到盛放上清液的鸡心瓶中，50℃旋转蒸发5 min，除去分散剂乙腈，出现明显分层，上层为水层，下层为混合离子液体，将鸡心瓶中液体于4℃、10 000 r/min离心3 min，取下层液过孔径为0.45 μm的滤膜后，备用待高效液相色谱检测。

1.3.3 萃取条件的优化

按照1.3.2操作方法处理10份加标样品，合并上清液至鸡心瓶后，调节鸡心瓶中液体pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。在进行旋转蒸发、离心、过膜操作后待高效液相色谱测定。

采用常规液-液萃取、盐析萃取、混合离子液体液-液分散萃取3种萃取方式，对比3种萃取方式对目标物的回收率。

常规液-液萃取：称取5.00 g待检测样品于离心管中，按顺序加入20 mL乙腈和10 mL还原剂，10 000 r/min均质1min，超声提取5 min，10 000 r/min离心3 min，得上清液和沉淀物，将该上清液转入鸡心瓶中，用5 mL乙腈洗涤沉淀物，将洗涤后的溶液合并到盛放上清液的鸡心瓶中，50℃旋转蒸发5 min，除去乙腈，在剩余液体中加入1.00 mL混合离子液体涡旋提取5 min，将所有液体于4℃、10 000 r/min离心3 min，取下层液过孔径为0.45 μm的滤膜后，备用待高效液相色谱检测。

盐析萃取：称取5.00 g待检测样品于离心管中，加入4 g氯化钠，其余步骤同常规液-液萃取。

混合离子液体液-液分散萃取：分别以乙腈、1%十二烷基硫酸钠水溶液、1%吐温-20水溶液为分散剂，按照1.3.2方法处理5份加标样品，分析对比使用不同分散剂的回收率。

1.3.4 高效液相色谱检测方法

检测条件：色谱柱C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙酸铵缓冲液（pH=3.5）∶乙腈为20∶80（V/V）；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样量：20 μL；激发波长：265 nm，发射波长：360 nm。

1.3.5 定性定量分析

以混合离子液体为溶剂，配制不同质量浓度的孔雀石绿及结晶紫混合标准溶液，依次分别为0.50ng/mL、1.00ng/mL、2.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL。以标准溶液质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制孔雀石绿及结晶紫标准溶液的工作曲线；根据测得的样品制备液的峰面积值，计算孔雀石绿及结晶紫的含量，待测水及水产品中孔雀石绿及结晶紫含量的计算公式如下：

式中：X表示试样中的孔雀石绿或结晶紫含量，ng/g；C1表示测得的样品制备液的峰面积所对应的孔雀石绿或结晶紫的含量，ng/mL；C0表示试样空白液中孔雀石绿或结晶紫的含量，ng/mL；m表示试样质量，g；V表示所用混合离子液体的体积，mL。

2 结果与分析

2.1 标准溶液及样品高效液相色谱检测结果

采用高效液相色谱法检测孔雀石绿及结晶紫标准溶液和样品，结果如图1所示。

图1 孔雀石绿及结晶紫标准溶液（a）及样品（b）高效液相色谱图Fig．1 HPLC chromatography of standard solution （a）and sample （b）of malachite green and crystal violet

由图1可知，孔雀石绿和结晶紫标准溶液的出峰时间分别为10.577 min和11.323 min，样品中孔雀石绿和结晶紫的出峰时间分别为10.547 min、11.293 min，孔雀石绿及结晶紫峰型对称，有较好的分离度，该波长下荧光信号响应强，说明该色谱条件能完全满足孔雀石绿及结晶紫的分离和检测。

2.2 提取液pH值对萃取效果的影响

考察样品提取液pH值对混合离子液体萃取效果的影响，结果如图2所示。

由图2可知，当样品提取液pH值范围在6.0～8.0时，萃取效果最好；当pH值从4.0～8.0变化时，萃取效率仅增加了不到2%，说明该混合离子液体对目标物的富集作用受pH值影响很小。孔雀石绿及结晶紫分子结构中并不含有可以成盐的酚羟基或者羧基，pH值的变化也不会改变两者分子状态，所以在较宽的pH值范围内，混合离子液体对两种目标物的富集效果基本不变，在萃取过程中不需要调节pH值，操作更简便。

图2 提取液pH对混合离子液体萃取效果的影响Fig．2 Effect of extracting solution pH on extraction of mixed ionic liquid

2.3 离子液体选择

考察不同种类离子液体对目标物萃取效果的影响，结果如表1所示。

表1 不同离子液体对目标物萃取效果的影响Table 1 Effect of different ionic liquids on the extraction of target objects

由表1可知，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐萃取目标物，回收率＜79%；1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐萃取目标物，回收率＜74%；由于1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐较1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐在结构上增加了更长的直链烷烃，共轭程度变弱，萃取效果略微降低。混合离子液体萃取效果明显强于其他两种常规离子液体，这说明常规离子液体对目标物有一定的富集作用，但是由于共轭性弱，导致吸附能力不如共轭程度较高的苯并咪唑离子液体。因此，选用混合型离子液体吸附目标物。

2.4 萃取方式对萃取效果的影响

考察不同萃取方式对混合离子液体萃取效果的影响，结果见表2。

表2 萃取方式对萃取效果的影响Table 2 Effects of extraction method on extraction

由表2可知，对孔雀石绿回收率常规液-液萃取最低，盐析法萃取次之，液-液分散萃取效果最优；对结晶紫回收率盐析法萃取最低，常规液-液萃取次之，液-液分散萃取效果最优。由于预先将混合离子液体溶于乙腈，再均匀的分散在提取液中，混合离子液体与目标物分子充分接触，增大萃取效率，达到最优萃取效果。因此，选择液-液分散萃取方式对孔雀石绿和结晶紫进行萃取。

2.5 不同种类分散剂对萃取效果的影响

考察不同分散剂对混合离子液体萃取效果的的影响，回收率计算结果见表3。

表3 不同分散剂对萃取效果的影响Table 3 Effects of different dispersants on extraction

由表3可知，以十二烷基磺酸钠水溶液为分散剂，孔雀石绿回收率为53.7%～62.5%，结晶紫回收率为52.8%～60.7%；以吐温-20水溶液为分散剂，孔雀石绿回收率为59.3%～64.4%，结晶紫回收率为51.7%～59.3%；乙腈作为分散剂回收率最好，且明显高于其他两种分散剂。乙腈作为分散剂更容易除去，离心后得到离子液体更多，回收率更高。因此，选择乙腈作为该实验过程中的分散剂。

2.6 线性方程、线性范围、相关性系数及最低检出限

配制不同质量浓度的孔雀石绿及结晶紫混合系列标准溶液，按照1.3.4方法采用高效液相色谱法检测，得到质量浓度对应的色谱峰面积，绘制标准工作曲线，分别得到孔雀石绿及结晶紫标准回归方程及方程相关系数（R2）。以3倍信噪比对应的质量浓度为仪器最低检出限，样品按5倍浓缩处理，可以计算出相应的方法检出限，结果见表4。

表4 孔雀石绿及结晶紫的线性回归方程、相关性系数、线性范围及检出限Table 4 Linear regression equation，correlation coefficient，linearity range and detection limit of malachite green and crystal violet

由表4可知，该方法线性范围较宽，线性关系良好（相关系数R2＞0.999），方法检出限低，均达到0.02 ng/g，适用于痕量检测和微量检测。由于离子液体不易挥发，进样体积稳定，且对目标物进行5倍浓缩富集，以便提高灵敏度，得到更低检出限。

2.7 回收率及重复性试验

在样品中加入不同质量浓度的标准溶液，试验平行5次。按照1.3方法进行样品处理和检测。计算每种添加水平的平均回收率和相对标准偏差（relativestandarddeviation，RSD），结果见表5。

表5 回收率试验结果Table 5 Results of recovery rate tests

由表5可知，本方法孔雀石绿和结晶紫的回收率分别为90.16%～93.73%和90.25%～93.88%，回收率较高。文献[11]提供的方法的孔雀石绿和结晶紫的回收率为78.3%～100.9%，国标方法的孔雀石绿和结晶紫的回收率为75%～85%，可见，用现有方法测定水和水产品中孔雀石绿及结晶紫时，孔雀石绿和结晶紫的回收率不够稳定。回收率结果的RSD值＜2.00%，表明该方法准确度高，可用于样品中孔雀石绿及结晶紫的检测。

2.8 样品中孔雀石绿和结晶紫的检测

在市场及超市随机抽取25份鱼肉样品，10份虾肉样品，5份养殖水样品，检测其中孔雀石绿及结晶紫含量，结果见表6。

表6 市售水产品中孔雀石绿及结晶紫的检测结果Table 6 Detection results of malachite green and crystal violet in aquatic products sold in the market

由表6可知，有一例鲤鱼样品检测出孔雀石绿。不合格率为2.5%，虽然孔雀石绿及结晶紫为非法添加药物，但市场中流通样品种类及数量非常庞大，仍然有少部分不法商贩在使用一些危害性很高的禁用药物。

3 结论

本试验采用共轭性高的苯并咪唑混合型离子液体液-液分散萃取技术对样品进行前处理预分离，用液相色谱方法分析养殖水及水产品中残留孔雀石绿及结晶紫。本试验优化了萃取pH值、萃取方式、离子液体种类、分散剂种类等条件，缩短了分析时间，提高了分析效率。结果表明，孔雀石绿和结晶紫的回收率分别为90.16%～93.73%和90.25%～93.88%，相对标准偏差（RSD）值＜2.00%，表明该方法对孔雀石绿及结晶紫的检测准确、可靠，适应大规模样品的快速分析要求。本研究为离子液体液-液分散萃取在食品安全方面的应用提供参考。

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Application of benzimidazole mixed ionic liquids in the detection of malachite green and crystal violet

WU Yongbao1,2,HONG Xia1,2,QIAN Yingwen1,2,GAO Zhiying1,2,LIU Qi1,2,ZHOU Xinkui1,2*
（1.Gansu Institute of Business and Technology,Lanzhou 730010,China;2.Gansu Zhongshang Food Quality Test and Detection Co.,Ltd.,Lanzhou 730010,China）

With 1-benzyl-3-ethyl benzimidazole hexafluorophosphate as extraction reagent,1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate as auxiliary solvent and carrier,mixing with 1∶9 （V/V）,the mixed ionic liquid was obtained.The extraction conditions of the malachite green and crystal violet in aquaculture water and aquatic products were optimized by mixed ion liquid liquid-liquid dispersion extraction.The contents of the malachite green and crystal violet were detected by high performance liquid chromatography-fluorescence detector.The results showed that selecting the mixed ion liquid for adsorption,with acetonitrile as a dispersant,the target objects were extracted in pH 4-8 by liquid-liquid dispersion extraction,and the extraction effect was good.The recovery rate of malachite green and crystal violet were 90.16%-93.73%and 90.25%-93.88%,respectively.The relative standard deviation （RSD）were 1.42%and 1.63%,respectively,which indicated that the established sample preparation method and detection method had high accuracy,and could be used for the detection of malachite green and crystal violet.

benzimidazole mixed ionic liquids;malachite green;crystal violet;liquid-liquid dispersive extraction;HPLC

TB34

0254-5071（2017）12-0163-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.034

2017-06-24

甘肃省科技计划资助（1606RTSA337，1309RTSA025，1605JTCA011）；甘肃省公共安全检验检测服务平台项目

吴永宝（1989-），男，工程师，硕士，主要从事食品检测工作。

*通讯作者：周鑫魁（1986-），男，工程师，硕士，主要从事有机合成、食品检测工作。