响应面法优化桑葚果酒发酵工艺

叶学林，程水明*，温露文，曾 霞，周国钰

（1.茂名市农业科学研究所，广东 茂名525000；2.广东省岭南特色果蔬加工及应用工程技术研究中心，广东普通高校食品科学创新团队，广东 茂名 525000；3.广东石油化工学院 环境与生物工程学院，广东 茂名 525000）

响应面法优化桑葚果酒发酵工艺

叶学林1，程水明2，3*，温露文3，曾 霞2，周国钰3

（1.茂名市农业科学研究所，广东 茂名525000；2.广东省岭南特色果蔬加工及应用工程技术研究中心，广东普通高校食品科学创新团队，广东 茂名 525000；3.广东石油化工学院 环境与生物工程学院，广东 茂名 525000）

以桑甚为原料，采用响应面法优化桑甚果酒的发酵工艺参数。在单因素试验基础上，选取起始糖度、起始pH值和主发酵温度作为影响因子，以桑甚果酒感官评分为响应值，通过响应面分析进行桑甚果酒发酵工艺优化。结果表明，在起始糖度22.6%，起始pH 3.6，主发酵温度15℃，接种量0.6%时所酿桑甚果酒酒体澄清透亮，香气协调馥郁，口感醇厚绵长，感官评分达88.64分。

桑甚果酒；发酵工艺；响应面法；优化

桑甚（Fructus mori）是多年生桑科落叶乔木植物桑（Morus alba）的果穗，又名桑枣、桑果。桑甚富含多种糖分、有机酸、维生素、花色苷、白藜芦醇、矿物质及多种人体所必需的氨基酸，富含营养物质并具药用价值，是我国权威公布的“药食两用”水果之一[1]。我国桑甚产量位居世界第一，将不易贮存的桑甚酿制成酒，既可减少原料浪费和环境污染，又可延长桑蚕产业链，提高桑蚕种植附加值，增加桑农收入，还可丰富果酒品种，使消费者的选择性更宽更广[2]。

桑甚的主要生物活性成分是类黄酮物质，其中的水溶性色素——花青素含量较高，花青素具有抗氧化、清除人体自由基的作用[3]。我国桑甚资源丰富，桑甚产量以及桑树品种均位居世界第一[4]。我国既是水果生产大国，也是水果消费大国，但水果加工业与发达国家相比较还有较大的差距，近年来才逐渐进入深加工处理阶段[5]。虽然市面上已经有了较具特色的桑甚酒[6]、桑甚茶[7]、桑甚醋[8]、桑甚膏以及桑果丁等各种桑甚加工产品。针对桑甚酒的开发研究也越来越多，但是总体来说桑甚的加工利用率并不高，原料浪费的问题依然非常突出。并且一些产品尚处在初步的小试或者中试阶段，还未形成规模化的产业链。因此，以桑甚为基础原料的产品加工在广度和深度方面仍需进一步提高，不断地推进桑甚产品规模化和工业化生产的进程。将不易贮存的桑甚酿制成酒，既可减少桑甚的堆积浪费和环境污染，又提高桑蚕种植附加值，丰富果酒品种[9]。

桑甚果酒作为一种新兴的保健型果酒，具有极高的营养价值。现今果酒市场上葡萄酒占据主导地位，但桑甚果酒中的蛋白质含量约为葡萄酒的8～9倍，微量元素硒含量比葡萄酒高12倍以上，且作为人体必需氨基酸之一的赖氨酸，在桑甚果酒中的含量是葡萄酒的9倍之多；此外，作为人们所熟知的天然抗氧化剂花青素，其含量为葡萄酒的5倍，桑甚果酒中还含有较高含量的白藜芦醇[10]，营养及保健功能均高于葡萄酒，为充分利用桑甚的资源优势，延伸蚕桑产业产品链，促进蚕桑传统产业的转型升级，本研究探讨起始糖度、主发酵的温度、起始pH值以及接种量对桑甚果酒风味的影响，此外，在单因素试验基础上，利用响应面法优化桑甚果酒发酵工艺条件，以期酿造出优质的桑甚果酒。同时也为桑甚果酒的发酵工艺提供相关的技术参数和科学支撑，为桑甚果酒的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

桑甚鲜果（品种粤椹大十）：茂名市蚕业技术推广中心；酿造果酒专用酵母RW：安琪酵母股份有限公司；降酸酵母Lalvin 71B：烟台帝伯仕自酿酒有限公司。

氢氧化钠：天津市百世化工有限公司；柠檬酸：天津市广成化学试剂有限公司；柠檬酸钠：天津市致远化学试剂有限公司；酚酞：广东光华科技股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

BSP-250生化培养箱：长春博迅生物技术有限责任公司；PHS-3C pH计：上海雷磁仪器厂；PAL-1数显糖度计：日本ATAGO爱宕公司；0～50%酒精浓度计：上海垒固仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑甚果酒的酿造工艺流程及操作要点

原料挑选→破碎榨汁→杀菌处理→成分调整→活化酵母→接种→主发酵→过滤分离→陈酿→成品果酒

操作要点：

原料挑选：剔除质量不佳的桑甚，挑选颗粒饱满、无病虫害、无腐烂的成熟桑甚作为酿酒原料。破碎榨汁：桑甚浸泡清洗后，榨汁机破碎榨汁，取果汁。杀菌处理：榨汁后，在桑甚汁中加入偏重亚硫酸钾（K2S2O5）杀菌，放置24 h。

成分调整：以白砂糖、柠檬酸和柠檬酸钠调整果汁的起始糖度和起始pH值。

菌种活化：1∶1的比例混合安琪酵母RW和降酸酵母Lalvin71B，取5g混合酵母于100mL的2%糖水中，37℃条件下摇床培养30 min，备用。

接种：将活化好的酵母以0.6%的接种量加到调配好的桑甚汁中。

主发酵：将接种后的桑甚汁置于不同的温度（15℃、20℃、25℃、30℃）条件下发酵7 d。每天测定残糖变化，以确保发酵正常进行。残糖不再变化时结束发酵。

过滤分离：主发酵结束后，将发酵液进行酒渣分离。

陈酿：将分离后得到的酒液进行密封陈酿，为避免氧化作用，应尽量满罐封藏，以减少酒体和空气的接触。于4℃条件下陈酿30 d。

1.3.2 发酵工艺优化单因素试验

选取起始糖度（16%、18%、20%、22%、24%、26%）、起始pH值（2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2）、主发酵温度（15 ℃、20 ℃、25℃、30℃）及接种量（0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%）为考察因素，定时取样检测发酵液残糖含量，依据残糖量变化情况确定发酵进程。陈酿结束后，测发酵液酒精度、挥发酸、残糖、总酸含量，探究不同因素变化对桑甚果酒发酵程度及风味的影响。

1.3.3 发酵工艺优化响应面优化试验

为优化桑甚果酒酿造工艺，在单因素试验基础上，选取接种量为0.6%，以起始糖度（A）、起始pH值（B）和主发酵温度（C）为影响因子，以感官评分（Y）为响应值，采用Box-Behnken设计进行试验，探究不同因素和水平对桑甚果酒品质的影响，获取优化工艺组合，利用优化工艺进行验证试验。Box-Behnken试验的因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验的因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.4 基本指标测定方法

酒精度、总酸（以酒石酸计）及挥发酸（以乙酸计）：分别按照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》酒精计法、电位滴定法及酸碱滴定法进行测定[11]；残糖：手持糖度计测定法；pH：酸度计法测定。

1.3.5 感官评定

感官评定评分指标和标准如表1所示。评分标准用语和评分细则具体参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的感官分析及葡萄酒感官评定要求[11]，满分100分，桑甚果酒感官评分标准见表2。

表2 桑甚果酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of mulberry wine

续表

1.3.6 数据处理

单因素试验数据利用Origin 9.0软件进行分析绘图，响应面试验数据采用Design-Expert.V8.0.6.1软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 起始糖度对桑甚果酒品质的影响

调整桑甚汁起始糖度分别为16%、18%、20%、22%、24%、26%，起始pH值3.6，接种量1%，25℃条件下恒温发酵7 d。陈酿结束后，取样测酒精度及残糖含量，考察起始糖度对桑甚果酒发酵的影响，结果见图1。

图1 起始糖度对桑甚果酒品质的影响Fig.1 Effect of initial sugar content on the quality of mulberry wine

由图1可知，起始糖度为24%时发酵液酒精度最高，达到14.1%vol。但相应残糖量也达到8.9%。糖既是酵母生长的碳源，也是酵母生长的能源。在厌氧条件下，酵母能将糖转化为乙醇。但起始糖度过高会导致高渗透压环境而不利于酵母生长繁殖，使得发酵不彻底[12]。由图1残糖量变化可知，发酵液起始糖度Ⅹ高，发酵结束后残糖量亦Ⅹ高。当起始糖度达26%，最终残糖量为10.7%。综合考虑各方因素，认为发酵液起始糖度以22%为宜。

2.1.2 起始pH值对桑甚果酒品质的影响

调整桑甚果汁起始pH值分别为2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2，起始糖度22%，酵母接种量1%，25℃条件下恒温发酵7 d，取样测酒精含量及残糖含量，考察起始pH值对桑甚果酒发酵的影响，测定结果见图2。

图2 起始pH值对桑甚果酒品质的影响Fig.2 Effect of initial pH value on the quality of mulberry wine

由图2可知，起始pH值为3.9时，酒精度达到最大值13%vol，但此时残糖量较高，达到8.5%。而当起始pH值为3.6时，酒精度达到12.7%vol，残糖量为8.2%。说明酵母在pH3.6以及3.9的环境中生长旺盛，对糖的利用较为彻底。但是当起始pH值达到4.2时，发酵液的酒精度急剧下降，残糖量也相应升高。结果表明，在pH为4.2的环境中，酵母的生长繁殖受到抑制。这可能是因为在该pH条件下，容易感染杂菌，从而影响了酵母菌的正常的代谢活动。在进行响应面优化时，选取起始pH值为3.3、3.6和3.9。

2.1.3 主发酵温度对桑甚果酒品质的影响

调整桑甚汁的起始糖度22%，起始pH值3.6，酵母接种量1%，将发酵液分别置于15℃、20℃、25℃、30℃条件下恒温发酵7 d，取样测桑甚果酒的酒精含量及残糖含量，考察主发酵温度对桑甚果酒发酵的影响，结果见图3。

图3 主发酵温度对桑甚果酒品质的影响Fig.3 Effect of main fermentation temperature on the quality of mulberry wine

由图3可知，随发酵温度升高，糖耗速率逐渐增加，发酵时间亦不断缩短。当主发酵温度为25℃时，达到最高酒精度12.5%vol，但残糖量也较高，为8.2%。可能是因为温度过高，酵母繁殖速率快，代谢旺盛，但同时，高温也会使得酵母较早地进入衰亡期，从而缩短了发酵周期[14-15]。而温度过低则会抑制酵母的生长繁殖，难以启动发酵，不利于酒精的积累，同时还易引起杂菌污染。综合考虑各方因素，发酵液主发酵温度定为20℃较为宜。

2.1.4 接种量对桑甚果酒品质的影响

调整桑甚汁起始糖度22%，起始pH值3.6，将接种量分别调整为0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%，25℃条件下恒温发酵7 d，取样测酒精含量及残糖含量，考察接种量对桑甚果酒发酵的影响，测定结果见图4。

图4 接种量对桑甚果酒品质的影响Fig.4 Effect of inoculum on the quality of mulberry wine

由图4可知，残糖量随着接种量的增加而呈现一定的波动。接种量过小，酵母生长缓慢，繁殖速率降低，糖耗速率也随之减小，最终使得残糖量过高。在接种量为0.2%～1.0%时，残糖量随接种量增加反而有所下降，当接种量增加至1.4%时，残糖量反而有所上升，这可能是因接种密度过大，导致溶氧不足，从而抑制了酵母的生长。若继续增大接种量，残糖量又出现下降，同时酒精度也降低，原因可能是由于酵母进行旺盛的生长繁殖而消耗了大部分的糖，因而也使得酒精产量降低[16]。综合考虑各方面因素，最终将酵母接种量定为0.6%。同时，考虑到接种量对整个发酵影响并不明显，故而在响应面试验中接种量不作为考察因子进行考虑。

2.2 响应面试验优化发酵参数

2.2.1 数学模型的建立及分析

在单因素试验基础上结合Box-Behnken设计，选取接种量为0.6%，以起始糖度（A）、起始pH值（B）和主发酵温度（C）为影响因子，以感官评分（Y）为响应值，设计3因素3水平响应面试验，以优化桑甚果酒发酵工艺参数，Box-Behnken试验结果见表2，采用Design-Expert.V8.0.6.1软件对表2试验数据进行回归模型方差分析，结果见表3。

用Design-Expert.V8.0.6.1软件对表2试验结果进行多元回归方程拟合，获得以感官评分为目标函数的二次回归拟合方程：

表2 Box-Behnken设计试验方案及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，用响应面法建立的二次回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.072 7＞0.05），说明所得模型拟合程度较好，该回归模型能够很好地对响应值进行预测。一次项C以及交互项BC为显著（P＜0.05），一次项A及二次项A2、B2为极显著（P＜0.01）。各因素对桑甚果酒感官评分的影响强弱次序为起始糖度（A）＞主发酵温度（C）＞起始pH值（B）。

2.2.2 影响因子间交互作用分析

固定一个参数在零水平，探究其余两个参数间的交互作用对桑甚果酒感官评分的影响[17-18]，其响应面及等高线见图5。

图5 起始糖度、起始pH值及主发酵温度交互作用对感官评分影响的响应面及等高线Fig．5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial sugar content，initial pH value and main fermentation temperature on sensory evaluation

由图5可直观地反⒊出起始糖度、起始pH值和主发酵温度之间的交互作用对感官评分的影响程度。响应面越陡峭，表明两因素间的交互作用越明显[19-20]。由图5可看出，起始pH值和主发酵温度的交互作用对桑甚果酒感官评分的影响显著（P＜0.05），其余因素间交互作用影响不显著（P＞0.05），这与方差分析结果一致。

2.2.3 验证试验

通过软件对所建立的模型进行分析，获得酿造桑甚果酒的最佳发酵工艺条件为起始糖度22.62%，起始pH值3.64，主发酵温度15℃，此时所酿造出来的桑甚果酒，其感官评分预测值可达到88.69分。考虑到实际操作的可行性，将发酵参数修正为起始糖度22.6%，起始pH值3.6，主发酵温度15℃，接种量0.6%，在此条件下检验该回归模型的可靠性，进行验证试验。经过3组平行试验，桑甚果酒的感官品评得分平均值为88.64分，与模型的预测值非常接近，表明了本试验所获得的回归模型方程具有良好的可靠性与实用性。

3 结论

在单因素试验基础上，选取起始糖度、起始pH值和主发酵温度为影响因子，以桑甚果酒的感官评分为响应值，采用响应面法优化桑甚果酒的酿造工艺。试验结果表明，最佳发酵工艺参数为起始糖度22.6%，起始pH值3.6，主发酵温度15℃，接种量0.6%。在此条件下所酿造的桑甚果酒，酒体澄清透亮，呈深紫红色，果香与酒香协调浓郁，口感醇厚绵长，酒体完整，酸度适中，典型性突出，感官评分达88.64分。为酿制优质的桑甚果酒提供了一定理论基础。

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Optimization of fermentation technology for mulberry wine by response surface methodology

YE Xuelin1,CHENG Shuiming2,3*,WEN Luwen3,ZENG Xia2,ZHOU Gouyu3
（1.Maoming Agricultural Science Research Institute,Maoming 525000,China;2.Food Science Innovation Team of Guangdong Higher Education Institutes,Technology Research Center for Lingnan Characteristic Fruits&Vegetables Processing and Application Engineering of Guangdong Province,Maoming 525000,China;3.College of Environmental and Biological Engineering,Guangdong University of Petrochemical Technology,Maoming 525000,China）

Using the mulberry as raw material,the fermentation process parameters of mulberry wine were optimized by response surface methodology.Based on single factor experiments,with initial sugar content,initial pH value and main fermentation temperature as the influence factors,the sensory evaluation score of mulberry wine as response value,the fermentation process of mulberry wine was optimized by response surface analysis.The results showed that in the conditions of initial sugar content 22.6%,initial pH value 3.6,main fermentation temperature 15℃and inoculum 0.6%,the mulberry wine obtained had clear and transparent wine body,harmonious and fragrant aroma,mellow and long taste,and the sensory score was up to 88.64.

mulberry wine;fermentation technology;response surface methodology;optimization

TS261.4

0254-5071（2017）12-0105-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.022

2017-10-10

广东省岭南特色果蔬加工关键技术及应用工程技术研究中心项目（粤科函产学研字[2015]1487号）；广东普通高校食品科学创新团队项目（2016KCXTD020）；广东省教育厅平台项目（2012gczxB001）

叶学林（1962-），男，高级农艺师，本科，研究方向为蚕桑技术与推广。

*通讯作者：程水明（1966-），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。