影响单酶法制备核桃多肽的因素研究

王纪辉，耿阳阳，侯 娜*，胡伯凯，何佳丽，梁 美

（1.贵州省林业科学研究院，贵州 贵阳 550005；2.贵州省核桃研究所，贵州 贵阳 550005）

影响单酶法制备核桃多肽的因素研究

王纪辉1，2，耿阳阳1，2，侯 娜1，2*，胡伯凯1，2，何佳丽1，2，梁 美1，2

（1.贵州省林业科学研究院，贵州 贵阳 550005；2.贵州省核桃研究所，贵州 贵阳 550005）

为寻求核桃多肽的最佳制备方法，以酶法水解核桃蛋白为基础，通过单因素和正交试验对核桃多肽制备工艺进行优化。结果表明，在酶解时间3 h、酶解温度38℃、pH 6.8、酶添加量4%、底物浓度为2.4%时，核桃多肽的抗氧化活性最佳，此时DPPH清除率可达92.35%。

核桃；多肽；酶解；制备；工艺

核桃（Juglans regia）又称胡桃、羌桃，为胡桃科植物。核桃不仅滋味鲜美，而且营养丰富，核桃蛋白富含18种氨基酸，其中人体必需氨基酸有8种[1]，且精氨酸和谷氨酸含量较高，这些成分对人体内细胞代谢至关重要，长期食用对人体具有很佳的保健功能，还能有效降低心血管疾病的发生率[2]。目前，制备食用油脂成为核桃仁主要的加工途径，榨油以后的核桃饼粕中蛋白质种类较为齐全、含量丰富[3]。然而核桃饼粕经过粗放的加工处理后，主要用作肥料或饲料，饼粕利用率极其低下，造成资源浪费[4]。提高核桃附加产值，高效利用核桃饼粕，提取其中蛋白质已成为后续多元功能产品生产中的首要研究任务[5]。

人体对蛋白质进行消化的主要方式是以肽的形式进行吸收，非单一氨基酸形式的小肽类，在人类的生命活动中具有重要的生理功能[6]，如抑制炎症发生、清除机体内自由基、延缓衰老，是潜在的天然、安全、高效抗氧化剂[7]，一直以来备受科学家和各国政府的高度关注。随着科技水平的提高，抗氧化肽类以一种非酶类自由基清除剂，正在食品、药品领Ⅱ蓬勃发展[8]。活性多肽不含脂肪，且其中氨基酸种类丰富，具有多种生理性能，符合人们对“低脂高蛋白”的食品需求，受到了广大消费者的喜爱[9]。近几年，抗氧化肽作为特效添加剂被应用于各种高档化妆品中；美国《未来科学》杂志预测到2025年，各类活性多肽产品将占发达国家国内生产总值的20%[10]。

目前，针对核桃榨油后核桃饼粕中多肽制备方面的科学研究较为少见。本研究以冷榨去除核桃油的核桃饼粕为原料，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除率为考察指标，以酶法水解核桃饼粕蛋白为基础，研究影响核桃抗氧化肽制备的因素，研究结果对充分利用核桃资源，提高核桃附加产值，促进核桃深加工尤为重要，而且对于助推贵州省脱贫攻坚，增加农民收入具有重要的现实意义[11]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃冷榨饼粕：实验室自制；正己烷（分析纯）：南京化学试剂股份有限公司；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、邻二氮菲、氢氧化钠（均为分析纯）：四川化工有限公司；DPPH（分析纯）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

50T型液压榨油机：河南贝斯德粮油机械工程公司；101-1型电热鼓风干燥箱：鹤壁市天冠仪器仪表有限公司；L5S型紫外可见分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；FD1A-50型冷冻干燥机：江阴市新申宝科技有限公司；FW-100型高速万能粉碎机：北京成萌伟业科技有限公司；TDL-40B型离心机：常州市仪都仪器有限公司；DEITA320型酸度计：上海平轩科学仪器有限公司；85-2A型恒温磁力搅拌器：常州金坛良友仪器有限公司；HH-54型恒温水浴锅：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 核桃饼粕蛋白制备

（1）核桃仁去皮：核桃去壳以后，按料液比为1∶5（g∶mL）加入一定量的0.6%NaOH溶液，65℃水浴搅拌15 min，然后用大量清水冲洗核桃仁进行去皮，60℃恒温干燥8 h后，用高速粉碎机进行中度粉碎，粉粹后粒度为5～10mm[12-13]。

（2）核桃仁脱脂：经过粉碎去皮后的核桃仁在30 MPa条件下进行冷榨40 min，制得核桃饼粕，粉碎后过100目筛[14]。按料液比1∶5（g∶mL）添加正己烷提取1 h后进行抽滤，收集残渣，经重复提取3次后，置于通风橱挥发溶剂，即得核桃脱脂粉，置于4℃冰箱保存备用[15-16]。

（3）核桃蛋白制备：经过脱脂后核桃粉按料液比为1∶26（g∶mL）加蒸馏水配制成蛋白质溶液，用酸度计调节溶液pH值为11.0，置于53℃恒温水浴中搅拌1.5 h[17]，然后以3 000 r/min离心20 min，取管中上清液用酸度计调节pH值达到4.5，搅拌1 h，以3 000 r/min离心20 min弃上清液后取沉淀，冷冻干燥后得核桃蛋白粗品[18]。

1.3.2 DPPH自由基清除能力测定

取2mL酶解液体、2mLDPPH溶液，混合摇匀后置于室温条件下，避光反应20 min，以3 000 r/min离心20 min，然后取上清液1mL加入具塞比色管中，用蒸馏水定容至10.0mL，混匀后，在波长517 nm处测其吸光度值，样品液平行测定3次，求其平均值[19]。DPPH自由基清除率计算公式如下：

式中：Ai为加酶解液后DPPH溶液吸光度值；Aj为不加DPPH，只加酶解液及无水乙醇的溶液吸光度值；A0为不加酶解液，只加DPPH及水的溶液吸光度值。

1.3.3 单因素试验优化核桃多肽制备工艺

分别选择木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶作为水解酶类，在底物浓度分别为0.6%、1.2%、1.8%、2.4%、3.0%，酶添加量分别为1%、2%、3%、4%、5%，酶解温度分别为28℃、33℃、38℃、43℃、48℃，pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，酶解时间分别为2 h、3 h、4 h、5 h、6 h的条件下，测定DPPH清除率，考察酶种类、底物浓度、酶添加量、温度、pH值、时间对核桃多肽清除DPPH效果的影响。

1.3.4 正交试验优化核桃多肽制备工艺

在单因素研究的基础上，依据单因素研究结果，选择酶解时间、pH值、酶添加量、底物浓度为研究因素，以DPPH自由基清除率为评价指标进行核桃抗氧化肽制备工艺优化。正交试验因素与水平见表1。

表1 核桃抗氧化肽制备工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factor and levels of orthogonal experiments for preparation conditions optimization of walnut polypeptide

1.3.5 统计分析

研究数据（3次数据平均值±标准偏差）采用Excel 2007制图及SPSS17.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶种类对抗氧化能力的影响

在底物浓度1.2%、酶添加量2%、酶解温度33℃、pH值6.0、酶解时间3 h的条件下，研究酶种类对DPPH清除效果的影响，结果见图1。

图1 酶种类对核桃多肽抗氧化能力的影响Fig.1 Effect of enzyme species on the antioxidant ability of walnut polypeptide

由图1可知，4种蛋白酶均能酶解核桃蛋白制备核桃多肽，但酶解能力两两之间存在差异（P＜0.05），4种酶均在最适条件酶解相同时间后，中性蛋白酶DPPH清除率达到最高（66.3%），效果最佳，因此选择中性蛋白酶作为酶解核桃饼粕蛋白后续水解用酶。

2.1.2 酶解时间对抗氧化能力的影响

以中性蛋白酶为水解酶，在底物浓度1.2%、酶添加量2%、酶解温度33℃、pH值6.0的条件下，研究酶解时间对DPPH清除效果的影响，结果见图2。

由图2可知，在一定范围内，核桃多肽DPPH清除率与时间呈现一定的量效关系，随酶解时间的延长，DPPH清除率呈逐渐上升的趋势，酶解4 h和5 h以及3 h与4 h之间不存在差异性，但与酶解时间1h、2h均呈显著性差异（P＜0.05），从实际操作考虑，选择酶解时间为3 h，此时DPPH清除率为65.2%。

图2 酶解时间对核桃多肽抗氧化能力的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on the antioxidant ability of walnut polypeptide

2.1.3 酶解温度对抗氧化能力的影响

以中性蛋白酶为水解酶，在酶解3 h，底物浓度1.2%、酶添加量2%、pH值6.0的条件下，研究酶解温度对DPPH清除效果的影响，结果见图3。

图3 酶解温度对核桃多肽抗氧化能力的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the antioxidant ability of walnut polypeptide

由图3可知，核桃多肽DPPH清除率随温度升高呈现先升高而后逐渐降低的趋势，在酶解温度为38℃时，DPPH清除率达到最大值（69.3%），并且与其他温度之间存在显著性差异（P＜0.05），此后核桃多肽清除率逐渐下降，究其主要原因是温度超过中性蛋白酶最适温度，导致蛋白酶变性失活，因此后续研究选择酶解温度为38℃。

2.1.4 pH值对抗氧化能力的影响

图4 pH值对核桃多肽抗氧化能力的影响Fig.4 Effect of pH on the antioxidant ability of walnut polypeptide

以中性蛋白酶为水解酶，酶解3 h，酶解温度38℃，在底物浓度1.2%、酶添加量2%的条件下，研究pH值对DPPH清除效果的影响，结果见图4。

从图4可知，pH值对核桃多肽抗氧化能力影响显著，核桃多肽抗氧化能力随pH值的升高呈先升高后降低的趋势；在pH值为7.0时，核桃多肽抗氧化能力最佳（72.4%），而且与其他梯度值之间有显著性差异（P＜0.05），而后pH值继续增大，DPPH清除率下降，所以选择pH值为7.0作为后续研究所需。

2.1.5 酶添加量对抗氧化能力的影响

以中性蛋白酶为水解酶，在酶解3 h，酶解温度38℃，pH值7.0，底物浓度1.2%的条件下，研究酶添加量对DPPH清除效果的影响，结果见图5。

图5 酶添加量对核桃多肽抗氧化能力的影响Fig.5 Effect of enzyme addition on the antioxidant ability of walnut polypeptide

由图5可知，DPPH清除率随酶添加量的增大逐渐升高，而后呈现下降趋势，其原因主要是酶解反应属于可逆反应，过多的产物会抑制酶解反应的进行；当酶添加量为4%时，DPPH清除效果最佳，此时DPPH清除率为71.3%，且与其他浓度梯度之间差异性显著（P＜0.05），因此选择酶的最适添加量为4%。

2.1.6 底物浓度对抗氧化能力的影响

图6 底物浓度对核桃多肽抗氧化能力的影响Fig.6 Effect of substrate concentration on the antioxidant ability of walnut polypeptide

以中性蛋白酶为水解酶，在酶解3 h，酶解温度38℃，pH值7.0，酶添加量4%条件下，研究底物浓度对DPPH清除效果的影响，结果见图6。

由图6可知，底物浓度能显著影响核桃多肽对DPPH的清除效果，并随底物浓度的增加逐渐增大而后趋于平衡，而且底物浓度为2.4%、3%之间以及1.2%与1.8%之间差异性不显著，与其他浓度梯度之间差异性显著（P＜0.05），底物浓度过低，中性蛋白酶与底物不能充分接触，核桃蛋白水解不充分；底物浓度过高时，酶的活性部位被底物所占据，酶解反应趋于缓慢，因此选择底物的最适浓度为2.4%，此时DPPH清除率为91.5%。

2.2 正交优化试验

在单因素试验的基础上，以酶解时间（A）、pH值（B）、酶添加量（C）、底物浓度（D）为试验因素，DPPH自由基清除率为考察指标，采用L9（34）正交设计研究不同因素对DPPH自由基清除效果的影响，正交试验结果与分析见表2，方差分析结果见表3。

表2 核桃多肽制备工艺条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for preparation conditions optimization of walnut polypeptides

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2、表3可知，以DPPH清除率为评价指标时，影响核桃多肽制备工艺的因素主次关系为A＞C＞B＞D，即酶解时间＞酶添加量＞pH值＞底物浓度，其最优的试验组合为A2B1C2D2，即酶解时间为3 h，pH值为6.8，酶添加量为4%，底物浓度为2.4%，酶解时间、pH值、酶添加量对结果影响显著（P＜0.05），底物浓度对结果影响不显著（P＞0.05）；在正交试验优化最佳条件下进行3次平行验证试验，DPPH清除率为92.35%。

3 结论

本研究对中性蛋白酶水解核桃饼粕蛋白制备核桃多肽工艺进行研究，通过单因素和正交试验确定了制备核桃多肽最佳工艺为酶解时间3h、酶解温度38℃、pH值6.8、酶添加量4%、底物浓度2.4%。研究结果表明，核桃多肽对DPPH自由基具有较好的清除效果，清除率高达92.35%，且表现出一定的量效关系，说明核桃多肽抗氧化能力显著，具有作为天然抗氧化剂进一步开发利用的市场前景。

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Factors affecting the preparation of walnut polypeptide by single enzyme method

WANG Jihui1,2,GENG Yangyang1,2,HOU Na1,2*,HU Bokai1,2,HE Jiali1,2,LIANG Mei1,2
（1.Guizhou Academy of Forestry,Guiyang 550005,China;2.Guizhou Institute of Walnut,Guiyang 550005,China）

In order to seek the optimum preparation method of walnut polypeptide,on the basis of enzymatic hydrolysis of walnut protein,the walnut polypeptide preparation process was optimized by single factor and orthogonal experiments.The results showed that the walnut polypeptide had the optimum antioxidant activity,with DPPH scavenging rate of 92.35%with the conditions of hydrolysis time 3 h,temperature 38℃,pH 6.8,enzyme addition 4%,and substrate concentration 2.4%.

walnut;polypeptide;enzymolysis;preparation;technology

Q93-331

0254-5071（2017）12-0068-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.014

2017-08-21

贵州省林业厅青年基金（黔林科合J[2015]13号）；贵州省核桃研发团队服务企业行动计划（黔科合服企[2015]4010号）

王纪辉（1988-），男，研究实习员，硕士，主要从事食品安全及食品发酵等研究工作。

*通讯作者：侯 娜（1983-），女，高级工程师，硕士，主要从事林木遗传育种研究工作。