大肠杆菌高密度发酵产木聚糖酶发酵条件优化

刘国锋

（1.湖南尤特尔生化有限公司，湖南 岳阳 414000；2.山东尤特尔生物科技有限公司，山东 邹城 273500）

大肠杆菌高密度发酵产木聚糖酶发酵条件优化

刘国锋1，2

（1.湖南尤特尔生化有限公司，湖南 岳阳 414000；2.山东尤特尔生物科技有限公司，山东 邹城 273500）

该试验对木聚糖酶工业大生产条件下的接种量、pH值、培养温度、溶氧、诱导时间、比生长速率进行了单因素优化试验。在此单因素试验基础上，选取对酶活影响较大的比生长速率、溶氧和pH 3个因素进行了正交试验优化。结果表明，优化后的发酵条件为接种量10%，发酵过程中溶氧值30%，生长期控制pH值为7.0，生长期培养温度37℃，生长期比生长速率为0.12 h-1，诱导期pH值为6.8，诱导期培养温度为35℃，诱导期比生长速率为0.14 h-1，在对数生长中期（OD600nm=30）时流加诱导培养基。优化后，放罐木聚糖酶活力最高可达149 000 IU/mL。该研究提升了大生产条件下的木聚糖酶活力，为木聚糖酶的工业化生产提供了指导。

大肠杆菌；木聚糖酶；发酵条件；优化

木聚糖水解酶是一种复杂的复合酶系统，广泛分布于自然界的细菌和真菌中。报道的木聚糖酶的来源主要有细菌、真菌、放线菌、酵母、藻类以及动物瘤胃中的细菌[1]。国内研究产木聚糖酶最多的菌株是木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillusniger）、棒曲霉（Aspergillus clavatus）等。 目前，已从20余种细菌、16种真菌、3种酵母以及8种放线菌中分离出相应的木聚糖酶[2]。木聚糖的酶法降解在食品工业、饲料工业、制药工业等众多行业中有着十分诱人的应用前景，尤其是近两年在造纸工业中成功运用木聚糖酶进行预漂白处理，使得木聚糖酶的厂家成为了一个热点，并取得了一系列重要的进展。

高密度发酵技术能提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量），不仅可以增加放罐体积、强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高产品在市场上的竞争力。这一目的的实现，除了重组菌本身的表达性质外，还必须给㈣重组菌生长和产物表达的最适环境条件，包括适宜的培养基组成、合适的培养温度、pH、比生长速率、适宜的溶解氧以及营养物的合理流加等。

目前，国内外的研究主要侧重于木聚糖酶酶学性质、木聚糖酶生产菌株构建、木聚糖酶应用等方面的研究。KHANDEPARKER R等[3]通过分子改造构建双功能木聚糖酶，发现同时具备木聚糖酶和纤维素酶活性的木聚糖酶应用前景巨大。SHEI J C等[4]从黑曲霉中分离出了一种内切木聚糖酶，该酶对纤维素、羧甲基纤维素、几丁质等都有水解作用。木聚糖酶为诱导酶，除了受基因工程菌的构建特性因素影响外，影响木聚糖酶发酵的因素通常有碳源、氮源、pH、温度和通气量等[5-6]，但是关于木聚糖酶规模化应用方面的研究较少。此外木聚糖酶产生菌分泌的代谢酶，包括蛋白酶和糖苷转移酶类，都会影响到木聚糖酶的产率，在确立木聚糖酶培养时间时必须要考虑到存在于培养基中的这些酶类的影响[7]。

为了解决木聚糖酶工业化生产中的实际问题，本研究采用碳氮源优化后的培养基，着重研究大生产中接种量、pH值、培养温度、溶氧、诱导时间、比生长速率等培养条件对菌体生长及木聚糖酶酶活的影响，以期为木聚糖酶的工业化生产提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

生产菌株[8]：重组大肠杆菌（Escherichia coli）：尤特尔生化有限公司。

1.1.2 化学试剂

葡萄糖：河北健民淀粉糖业有限公司；乳糖、甘油：武汉莱恩化工有限责任公司；硫酸铵：中国石油化工股份有限公司巴陵分公司；磷酸二氢钾：武汉无机盐化工有限公司；氯化钠：湖南省湘衡盐化有限责任公司；蛋白胨：山东梁山蛋白胨生物制品有限公司；无水磷酸氢二钠：云南昆阳磷肥厂有限公司。

1.1.3 培养基

LB培养基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.5，121℃灭菌20 min。

种子培养基：蛋白胨10.0 g/L、酵母浸膏10.0 g/L、NaCl 5.0g/L；聚丙二醇（polypropyleneglycol，PPG）-20000.01mL，pH 7.5，121℃灭菌20 min。

发酵培养基：葡萄糖18.0 g/L、酵母浸膏3.0 g/L、柠檬酸3.0 g/L、硫酸铵3.5 g/L、PPG-2000 0.05 mL、MgSO4·7H2O 1 g/L、磷酸二氢钾12.0 g/L、氯化钙0.2 g/L和微量盐贮液，pH值自然，121℃灭菌30 min。微量盐贮液组成如下：乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）8.4 mg/L，柠檬酸铁100.0 mg/L，Zn（CH3COO）2·2H2O 13.0 mg/L，CoCl2·6H2O 2.5 mg/L，MnCl2·4H2O 15.0 mg/L，CuCl2·2H2O 1.5 mg/L，硼酸 3.0 mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.5 mg/L。培养基灭菌条件为：115℃灭菌20 min。

补料培养基：甘油500.0 g/L、MgSO4·7H2O 10.0 g/L、氯化钙1.0 g/L，pH值自然，121℃灭菌30 min。

诱导培养基：甘油100.0g/L、MgSO4·7H2O2.0g/L、乳糖240.0 g/L、氯化钙0.2g/L，pH值自然，121℃灭菌30min。

1.2 仪器与设备

SPX-250B-Z型生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备；2 m3304不锈钢种子罐、20 m3304不锈钢发酵罐：岳阳龙辉检修安装有限公司；755S紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；Phs-3CP pH仪：上海雷磁仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 培养条件

小罐种子培养采用2 m3种子罐，初始培养基体积1 m3，接种摇瓶种子3 000 mL，接种时加入维生素B1和卡那霉素，培养温度37℃，通气量1.2 m3/min，罐压0.03 MPa，待空气量加足后开启搅拌，搅拌转速200 r/min培养8 h，将其作为种子液。

发酵采用20 m3发酵罐，初始培养基体积10 m3，调整好培养温度后接种小罐种子，接种前通过小罐接种口加入维生素B1和卡那霉素，通入空气，待空气量加足后开启搅拌，用20%氨水调节pH值。待还原糖降至0.3 g/100 mL，指数流加生长培养基。至一定OD600nm值时，指数流加诱导培养基。至OD600nm值比最高时下降5～10个单位后停止发酵。

1.3.2 分析检测

细胞密度的测定：取适量菌液，用分光光度计测定适当稀释至吸光度值0.2～0.4后，其波长在600 nm处的吸光度值（OD600nm）。

木聚糖酶酶活的定义：在50℃，pH 6.50中性条件下，每分钟从质量浓度为5 mg/mL的燕麦木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个活力单位（IU/mL）。采用高效液相色谱法测定木糖含量，色谱条件如下：Aglient HPX-87H色谱柱（300 mm×7.8 mm）；检测器：示差检测器（refractiveindexdetector，RID）温度控制在55℃；柱温65℃；流动相5mmol/L硫酸溶液；流速：0.6mL/min；进样量：10μL。

1.3.3 发酵条件优化

接种量的确定：分别以3%、6%、8%、10%、12%的接种量接种于发酵罐培养基中，37℃培养，通入空气培养8 h，定时取样测OD600nm值和酶活。

溶氧量的确定：发酵过程中，分别将溶氧控制在10%、15%、20%、25%、30%，37℃培养，其他条件不变，发酵培养52 h后测OD600nm值和酶活。

诱导时机的确定：分别在对数生长的前期、中期及后期指数流加诱导培养基（具体优化方法见结果讨论），37℃，其他条件不变，发酵培养52 h测OD600nm值和酶活。

pH值的确定：在OD600nm值至30时指数流加诱导培养基，诱导期分别将pH值控制在6.4、6.6、6.8、7.0，37 ℃培养，其他条件不变，发酵培养52 h后测OD600nm值和酶活。

比生长速率的确定：根据前期试验摸索，生长期细胞比生长速率为0.12 h-1有利于菌体生长和产物积累，而诱导期的比生长速率需要进行优化。诱导时设定不同的细胞比生长速率补料进行优化，37℃培养，其他条件不变，发酵培养52h后测OD600nm值和酶活。

因发酵设备的限制，无法连续改变补料体积，故采用每1 h改变补料体积的阶梯式的补料方式。设定比生长速率（μset），根据下列公式计算流加率：

式中：F为流加率，L/h；X（t0）为补料开始前细胞干质量，g/L；V（t0）为补料开始前发酵液体积，L；SF为补料培养基葡萄糖的质量浓度，g/L；m为保持系数0.025，（g·g/h）[9]；Yx/s为产出系数，即每克葡萄糖产生细胞干质量，g/g。

每克葡萄糖产生细胞干质量计算公式如下：

式中：ODb为补料开始前的发酵液的OD600nm值；OD0为发酵开始时的OD600nm值；0.54为1 OD600nm值相当于1 L发酵液中含有的细胞干质量为0.573 g；Vm为发酵合成培养基的初始体积，L；Vi为发酵种子液的体积，L；Vs为取样体积，L；S为合成培养基中含有的葡萄糖的总量，g。

温度优化：在OD600nm值至30时指数流加诱导培养基，诱导期分别将培养温度控制在34℃、35℃、36℃、37℃、38℃，其他条件不变发酵培养52 h后测OD600nm和酶活。

1.3.4 数据分析

所有实验均为3个平行实验，所得数据为3个平行实验平均值。

2 结果与分析

2.1 接种量对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响

接种量的大小决定菌种在发酵罐中的生长速度。采用低接种量，会使菌种生长缓慢，发酵周期延长。接种量大，有利于对基质的利用，缩短生长延滞期，并使生长菌迅速占领整个培养环境，但过度接种量会使菌体生长过快，影响后期的生长，在一定范围内增加接种量有利于菌体生长。不同接种量对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响结果见图1。

图1 不同的接种量对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响Fig.1 Effects of different inoculum on xylanase production by E.colifermentation

由图1可知，除3%和6%的接种量外，其余接种量菌体浓度差距不大。接种量为10%时木聚糖酶酶活最高，3%接种量酶活最低。考虑到在大规模发酵过程中，接种量过小菌体增值缓慢和接种量过大对菌体生长和酶转化得率会产生一定抑制作用[10]，并出于种子罐和发酵罐消毒灭菌时操作方便及生产成本考虑，确定10%为最佳接种量。

2.2 溶氧对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响

在微生物培养时，必须不断地向培养液提供足够的氧，以满足微生物生长代谢的需要。由于微生物的新陈代谢与氧气呼吸有关，调节通气和搅拌可影响发酵周期时间的长短和代谢产物生成的高低。

大肠杆菌菌体在高密度培养时，耗氧剧增，发酵罐内溶氧水平逐渐下降。当培养液内的溶解度降低到临界浓度以下，此时再加大补料速度，将会导致菌体呼吸停止或厌氧发酵，并可能造成菌体自溶。在其他工艺参数不变的基础上，考察不同水平的溶氧对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响，在发酵培养52 h后测酶活，结果见图2。

图2 不同的溶氧量对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响Fig.2 Effects of different dissolved oxygen contents on xylanase production byE.colifermentation

由图2可知，生产中溶氧＜20%时，菌体生长明显受到抑制，酶活水平降低，溶氧＞25%酶活增长不显著。在高密度发酵末期，发酵罐的溶氧成为限制菌体生长的制约因素[11-12]。受设备⒉件因素制约，发酵后期溶氧最大只能达到31%，未能继续通过提高溶氧值来研究对发酵的影响。从生产成本上考虑，过度增加溶氧会增大生长能耗，提高了生产成本。因此，选用25%溶氧对发酵生产有利。

2.3 诱导时机对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响

对于许多带有诱导型启动子的重组微生物，只有将生长期和产物形成期分开才能获得最大生产率。在流加培养中，这两段时期的分离可以通过延迟诱导直至细胞生长已达到高密度来实现。提早诱导造成菌体密度和中性木聚糖酶酶活降低，同时增加了染菌的机会，而诱导较晚，虽可能获得高菌体密度，但细胞表达时间减少，导致木聚糖酶酶活降低。20m3发酵罐水平大肠杆菌生长曲线见图3，不同诱导时机对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响见图4。

图3 20 m3发酵罐水平大肠杆菌生长曲线Fig.3 Growth curve ofE.coliin the 20 m3fermenter

由图3可知，对数生长前期的OD600nm值为21，对数生长中期OD600nm值为30，对数生长后期OD600nm值为40，分别在上述3个生长期流加诱导培养基。

图4 不同的诱导时间对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响Fig.4 Effects of different induction period on xylanase production byE.colifermentation

由图4可知，生长期时间越长，诱导期时间越短，虽然菌体密度越大，但酶活水平相对不高。生长期时间越短，诱导期时间越长，菌体密度相对较小，酶活水平也不高。因此，在对数生长中期（发酵至第13～15小时，OD600nm值=30）时流加诱导培养基较好。

2.4 pH值对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响

大肠杆菌生长的最适pH值为7.0～7.2，降低pH对控制较低的比生长速率有利，但会延长发酵周期。在发酵罐生长期pH控制在7.0，诱导期采用不同pH值进行培养，不同pH值对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响，结果见图5。

图5 不同的诱导期pH对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响Fig.5 Effects of different pH value during induction period on xylanase production byE.colifermentation

由图5可知，同周期条件下诱导期pH值越高，菌体浓度越高，但pH＞6.8后，尽管菌体浓度提高，酶活反而下降。pH值为7.0时，菌体生长速度快，但过快的生长导致质粒丢失，从而影响酶活水平。pH值6.8时，有利于产物表达。采用pH梯度法，即生长期控制pH为7.0，诱导期pH为6.8，能较好地解决这一问题。

2.5 诱导期比生长速率对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响

比生长速率是每小时单位体积的菌体所增加的菌体量，其对细胞生长和产物形成均有重要作用。在发酵的补料分批发酵中使用指数流加补料培养策略被认为是避免产生有毒代谢物和增加细胞密度的最有效的方法。在同周期条件下，每隔1 h取样测定OD600nm值，计算菌体的比生长速率，考察在诱导期通过调整补料速度来控制不同比生长速率，进而影响发酵的酶活，结果见图6。

图6 不同的比生长速率对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响Fig.6 Effects of different specific growth rate on xylanase production byE.colifermentation

由图6可知，比生长速率在0.14 h-1以下时，酶活随比生长速率加快而增加，比生长速率在0.20 h-1以上时，酶活随比生长速率加快导致质粒被丢失而下降，比生长速率在0.30h-1以上时，菌体生长被抑制。本试验采取指数补料流加策略进行高密度发酵，设定补料的比生长速率为0.14 h-1，低于产生乙酸的比生长速率，细胞密度呈指数的增长，能有效避免代谢副产物乙酸的产生。因此，发酵生产中将比生长速率控制在0.14～0.20h-1较为合适。有时细胞在低比生长速率下最终获得重组蛋白的量反而要比高比生长速率的细胞高一些[13]。本研究的试验结果也证明了上述观点。

2.6 培养温度对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响

大肠杆菌发酵最适生长温度是37℃，但最适木聚糖酶生产温度需要进一步优化。在重组大肠杆菌的发酵过程中不同发酵阶段采用不同温度，在前期可将温度调至最适菌体生长的温度，到诱导阶段将温度调至最适木聚糖酶生产的温度。本研究在生长期采用37℃培养，诱导期采用不同培养温度，考察不同的培养温度对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响，结果见图7。

由图7可知，诱导期温度升高增加菌体密度，但超过35℃菌体密度增加不明显，且酶活逐渐下降。一些大肠杆菌重组蛋白在温和启动子下的表达量高于强启动子[14]，低温诱导的表达量高于高温诱导[15]就证实了这一观点。培养温度升高加快了菌体的生长速率，有可能导致质粒被丢失。大肠杆菌生长速率降低，有利于工艺控制，同时乙酸及其它抑制性副产物的形成也随之减少。生长期采用37℃培养，诱导期采用35℃培养，有利于中性木聚糖酶的表达。

图7 不同的诱导期培养温度对大肠杆菌发酵产木聚糖酶的影响Fig.7 Effects of different culture temperature during induction period on xylanase production byE.colifermentation

2.7 发酵条件优化正交试验

在单因素的基础上，以木聚糖酶活为考察指标，选择对酶活影响较大的比生长速率、溶氧和pH，进行3因素3水平的正交试验，其结果与分析见表1。

表1 发酵条件优化正交试验结果与分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表1可知，各因素对木聚糖酶活力的影响大小为溶氧＞比生长速率＞pH，最优的发酵条件组成为A2B2C3。优化后的发酵条件为接种量为10%，发酵过程中溶氧值为30%，生长期控制pH值为7.0、生长期培养温度为37℃、生长期比生长速率为0.12 h-1，诱导期pH值为6.8、诱导期培养温度为35℃、诱导期比生长速率为0.14 h-1，在对数生长中期（OD600nm值=30）时流加诱导培养基。在此发酵条件进行优化后，酶活力可达149 000 IU/mL。一般认为菌体密度高于50 g/L即为高密度发酵，根据材料方法1.3.3的计算方法，获得的菌体浓度可达65.90 g/L，达到高密度发酵水平。

3 结论

本试验研究了大生产中接种量、pH值、培养温度、溶氧、诱导时间、比生长速率等培养条件对菌体生长及木聚糖酶酶活的影响，并在此基础上选择比生长速率、溶氧和pH，进行了正交试验。优化后的发酵条件如下：接种量为10%，发酵过程中溶氧值为30%，生长期控制pH值为7.0、生长期培养温度为37℃、生长期比生长速率为0.12 h-1，诱导期pH为6.8、诱导期培养温度为35℃、诱导期比生长速率为0.14 h-1，在对数生长中期（OD600nm值=30）时流加诱导培养基。优化后，放罐酶活力可达149 000 IU/mL。本研究为木聚糖酶的工业化生产奠定了坚实基础。

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Optimization of high density fermentation conditions ofEscherichia colifor xylanase production

LIU Guofeng1,2
（1.Hunan Youtell Biochemical Co.,Ltd.,Yueyang 414000,China;2.Shandong Youtell Biochemical Co.,Ltd.,Zoucheng 273500,China）

The fermentation conditions,such as,inoculum,pH value,culture temperature,dissolved oxygen,induction time and specific growth rate in the production of xylanase industry were optimized by single factor experiments.On the basis of the single factor experiments,the specific growth rate,dissolved oxygen and pH were optimized by orthogonal experiments.The results showed that the optimum fermentation conditions were inoculum 10%,dissolved oxygen 30%during fermentation,growing period pH value 7.0,growing period culture temperature 37℃,growing period specific growth rate 0.12 h-1,induction period pH value 6.8,induction period culture temperature 35℃and induction period specific growth rate 0.14 h-1.The induction medium was added in the middle of logarithmic phase （OD600nm=30）.After optimization,the highest xylanase activity could be up to 149 000 IU/ml.The study improved the xylanase activity under the conditions of mass production,which provided guidance for the industrial production of xylanase.

Escherichia coli;xylanase;fermentation conditions;optimization

TS201.3

0254-5071（2017）12-0063-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.013

2017-08-20

科技型中小企业技术创新项目（14C26213701984）

刘国峰（1980-），男，工程师，硕士，研究方向为酶工程。