鸭坦布苏病毒分离鉴定及全基因组序列分析

王宾宾，闫大为，倪欣涛，李雪松，滕巧泱，杨健美，陈鸿军，刘芹防，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

鸭坦布苏病毒分离鉴定及全基因组序列分析

王宾宾，闫大为，倪欣涛，李雪松，滕巧泱，杨健美，陈鸿军，刘芹防，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

本文采集2015年浙江省2个鸭养殖场中疑似鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）感染的雌麻鸭卵巢病料，经组织研磨处理，DF-1细胞纯化，成功分离了2株鸭坦布苏病毒（DTMUV），分别命名为ZJ201501和ZJ201504。利用9对两两相互重叠的PCR引物，对这2株病毒的全基因进行分段PCR扩增，经序列测定和拼接，得到病毒的全基因组序列。核苷酸序列和E蛋白氨基酸序列比对分析发现：ZJ201501和ZJ201504的核苷酸同源性高达99.9%，全长氨基酸仅有2个位点差异；与选取的19株DTMUV参考序列相比，在核苷酸水平和E蛋白氨基酸水平上，其同源性分别大于97.1%和98.4%，而ZJ201501和ZJ201504与早期分离的DTMUV FX2010遗传距离最远，这表明DTMUV在鸭群中发生了一定的变异。本研究为进一步了解DTMUV的遗传进化提供了理论依据。

鸭坦布苏病毒；分离鉴定；全基因组序列测定；进化树

鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）属于黄病毒科黄病毒属，单股正链RNA病毒，基因组全长约11 kb，只有一个ORF，编码一个多聚蛋白，由3425个氨基酸组成。其前体多聚蛋白在宿主信号肽酶和病毒丝氨酸蛋白酶的催化下切割成为3种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白（C）、膜蛋白（PrM/M）和包膜蛋白（E）以及7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）[1]。自2010年4月鸭坦布苏病毒病首次在中国爆发以来[2]，该病就迅速传播至浙江省、福建省、江苏省、山东省、江西省、广东省、广西省、安徽省、河南省、河北省、北京市等地[3,4]，且近几年均有感染DTMUV的报道[5-7]。鸭坦布苏病毒病作为一种急性传染病能够引起肉鸭生长缓慢，产蛋鸭产蛋下降，共济失调和瘫痪等临床症状，发病率高达100%，死亡率达5%～15%[8-10]，给我国鸭养殖业造成了严重的危害。DTMUV能够感染多种宿主如鸭、鸡、鹅、鹦鹉、蚊子、小鼠等[11-14]。因此，加强对DTMUV的分离鉴定及其遗传变异等研究对于该病的监测、防控以及保护我国鸭养殖业的发展具有重要意义。

本文对2015年9月浙江省宁波市和余姚市2个养鸭场出现产蛋鸭产蛋下降等疑似DTMUV感染症状的发病鸭进行卵巢组织采集，成功分离和鉴定出2株DTMUV，分别命名为ZJ201501株和 ZJ201504株，并进行了系统进化树的分析，为进一步了解DTMUV的遗传进化奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 DF-1细胞由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 RNAiso Plus、M-MLV逆转录试剂盒购自TaKaRa公司；2×PCR Mix购自广州东盛生物科技有限公司；AXYGEN胶回收试剂盒购自康宁生命科学有限公司；DMEM培养液购自拜力生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）购自赛默飞世尔公司。

1.2 引物

1.2.1 鉴定引物 DTMUV特异性鉴定引物，826F：5'-CATAGGCTGGAATCTGGGAAC-3'，1126R：5'-TCTGGATTCTGTCGTCACGTC-3'。

1.2.2 反转录引物及分段PCR扩增引物 为了获得覆盖DTMUV全基因组的cDNA，根据Genbank中的DTMUV的保守序列设计了8条反转录引物，见表1。为了扩增DTMUV全基因组序列，设计了9对两两相互重叠的PC R引物，见表2。

表1 反转录引物Table 1 RT primer

1.3 样品采集及处理

样品分别来源于浙江省宁波市和余姚市2个发生产蛋鸭产蛋下降的养鸭场，在发病后d3，分别无菌剖杀3只发病鸭并采集脾脏和卵巢组织，低温下送到实验室，加入含10×双抗的无菌PBS（1 mL/g）后，置于高通量组织研磨器中研磨，将研磨液经12 000×g，4℃离心15 min，取上清液体经直径0.22 μm滤器过滤后，分装置于-80℃保存备用。

1.4 病毒分离

将长有80%单层DF-1细胞的T25细胞培养瓶用无菌PBS漂洗2次，加入900 μL DMEM培养基和100 μL样品，混匀后置于含5% CO2、37℃细胞培养箱感作2 h，每隔0.5 h晃动一次以使病毒感作均匀，2 h后弃去混合液，并用无菌PBS漂洗2次，最后加入5 mL含2%FBS的DMEM培养液，每隔12 h观察细胞是否出现病变。若出现病变，收集上清分装保存于-80℃。

1.5 RNA抽提

取300 μL样品置于2 mL无RNA酶的EP管中，加入700 μL RNAiso Plus，室温静置5 min；加入200 μL氯仿充分混匀并静置2 min后，4℃、12 000×g离心10 min；小心吸取上层水相移至于另一干净无RNA酶的EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后室温静置10 min；4℃、12 000×g离心10 min后，弃去上清，加入新配置的75%乙醇洗涤管内沉淀，4℃、12 000×g离心10 min，弃去上清；将EP管倒置室温放置10 min使其干燥，加入20 μL DEPC水溶解沉淀。

表2 鸭坦布苏病毒全基因组分片段扩增引物序列Table 2 Amplification primers of DTMUV whole genome

1.6 反转录

以上述提取的RNA为模板，8条特异性反转录引物（表1）等比例混合作为反转录引物，按M-MLV逆转录试剂盒进行反转录，具体操作如下：9 μL RNA，与3 μL反转录引物混合液于无RNase的PCR管中，置于PCR仪中70℃、10 min后迅速置于冰上2 min，向上述混合液中依次加入6 μL 5×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer、3 μL 10 mmol/L dNTP，1 μL RNase Inhibitor、1 μL M-MLV Reverse Transcriptase、7 μL DEPC水，然后置于PCR仪进行反转录。反应条件：30℃，15 min；42℃，1 h；75℃，10 min。

1.7 PCR扩增

以上述cDNA为模板，2×PCR Mix扩增，具体反应体系：25 μL 2×PCR Mix，2 μL上游引物，2 μL下游引物，2 μL cDNA，19 μL DEPC水进行PCR扩增。PCR扩增条件：94℃预变性2 min；（94℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸，时间据基因大小来定）×30 个循环；72℃延伸10 min。

1.8 全基因组序列测定

将PCR反应液经1%琼脂糖凝胶进行电泳反应，并将目的条带在紫外照胶仪下进行切胶回收，按照AXYGEN胶回收试剂盒步骤进行PCR产物的回收纯化，将此目的条带送至上海美吉生物公司进行测序，将测序结果运用Seqman软件进行序列拼接得到全基因组序列。

1.9 序列分析及DTMUV系统发育树构建

为了分析DTMUV近几年的遗传进化和抗原性变化，从Genebank中随机选取不同年份的19株DTMUV序列（GenBank登录号：YY5，JF270480；TA，JQ289550；BYD-1，JF312912；GX，KC990542；S D M S，K C3 3 3 8 6 7；S X 1，K M 0 6 69 45；GX2013G，KM275941；CQW1，KM233707；JS06，KR869106；AH2011，KJ958533；df-2，KJ489355；FS，JN811558；JM，JN811559；WR，JX196334；WFZ，KC990545；WJ-1，JX549382；XZ 2012，KM188953；JS804，JF895923；FX2010，KY623434），以早期分离到的DTMUVFX2010作为进化树根，分别选取DTMUV的ORF核苷酸和E蛋白，利用Mega7.0软件，运用邻近法进行系统发育树的构建和序列比对。

2 结果

2.1 病毒分离及鉴定结果

病料接种DF-1细胞48 h后，细胞开始出现变圆、皱缩、聚堆等眼观病变，部分细胞脱落。60 h后，60%的细胞发生病变，收取出现病变的细胞上清进行RNA抽提、反转录得到cDNA，以cDNA为模板，利用DTMUV特异性鉴定引物进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，2和3泳道出现300 bp大小的特异条带（图1），表明病料中含有DTUMV，分别命名为ZJ201501和ZJ201504。

图1 病料中DTMUV基因组的RT-PCR鉴定Fig.1 RT-PCR products of DTMUV from the two samples M: DNA分子质量标准(DL2000); 1: 对照; 2～3: 样品M: DNA Marker(DL2000); 1: Control; 2-3: Samples

2.2 全基因组分段扩增结果

以鉴定为DTMUV阳性的样品ZJ201501和ZJ201504 cDNA为模板，9对两两互相重叠的引物（表2）进行PCR扩增，经1%核酸凝胶电泳分别得到了大小为1000～1500 bp左右的9条片段（图2和图3）。

2.3 全基因组序列测定

将ZJ201501和ZJ201504的9个目的片段分别依次进行切胶、回收和测序，运用Seqman软件对其测序结果分别进行拼接得到其完整的序列；ZJ201501和ZJ201504的全长分别是10 991 bp和10 992 bp，均只有1个ORF，长度为10 278 bp，编码3625个氨基酸。目前，这2株病毒的序列已经提交至Genbank，其登录号分别是KY623435和KY623432。

2.4 序列分析及系统进化树及构建

图2 DTMUV ZJ201501株全基因组分段RT-PCR扩增结果Fig.2 RT-PCR Amplification results of DTMUV ZJ201501 strain

图3 DTMUV ZJ201504株全基因组分段RT-PCR扩增结果Fig.3 RT-PCR Amplification results of DTMUV ZJ201504 strain

利用MegAlign软件进行序列比对，发现ZJ201501和ZJ201504在ORF核苷酸水平上具有高达99.9%的同源性，仅有2个氨基酸位点的差异，分别位于E蛋白281位点和NS5蛋白839位点上。运用Mega7.0软件，以Genbank中选取的19条序列为参考序列，选取邻近法基于全基因序列水平和E蛋白氨基酸水平进行系统发育树的构建（图4），ZJ201501和ZJ201504位于同一个分支上，与其他DTMUV在ORF核酸和E蛋白上的同源性分别高于97.1%和98.4%，与2013年分离的GX2013G和CQW1的遗传距离较近，但与2010年分离的DTMUVFX2010遗传距离较大；无论是从基于ORF核苷酸还是E蛋白构建的系统发育树来看，ZJ201501 和ZJ201504均与DTMUV-FX2010有较大的差异，进一步分析序列发现，共有16个氨基酸位点的差异，其在C、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4B和NS5蛋白上分别有1、4、3、4、1、1、1和1个氨基酸位点差异（表3）。

图4 基于DTMUV全基因序列（A）或E蛋白（B）构建的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on complete genomic sequence (A) or E protein(B) of DTMUVs

表3 不同鸭坦布苏病毒分离株的氨基酸位点差异Table 3 The amino acid changes of different DTMUV strains

3 讨论

DTMUV属于黄病毒科黄病毒属，黄病毒属的大多病毒如登革病毒（Dengue virus，DENV），西尼罗河病毒（West nile virus，WNV），寨卡病毒（Zike virus，ZIKV），日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），黄热病毒（Yellow fever virus，YFAV），森林脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus，TBEV）等[15]都能够通过虫媒感染哺乳动物，甚至对人类有很强的致病性。自2010年鸭坦布苏病毒病首次在中国爆发以来[2]，随后的几年持续有不同动物感染DTMUV的报道[5-7]，但2015年关于该病感染的报道很少，这是否因为DTMUV的抗原性等发生改变，导致病毒感染能力下降从而使鸭坦布苏病毒病流行程度降低尚不知晓。为了探究DTMUV的遗传进化和抗原性变异，本研究利用病毒分离、RT-PCR技术对2015年浙江2个鸭养殖场的6份病料成功分离鉴定到2株DTMUV，分别命名为ZJ201501和ZJ201504。随后，利用全长分段RTPCR扩增、序列测定、序列拼接方法成功得到2株病毒的全基因序列。

从GenBank中按年份随机选取了19株DTMUV的序列，与ZJ201501和ZJ201504的全基因序列和E蛋白氨基酸序列分别进行系统发育树构建。在全基因序列水平上，ZJ201501和ZJ201504在同一个分支上，位于进化树的最上端，与其他19株病毒有97.1%以上的同源性；在E蛋白氨基酸水平上，ZJ201501和ZJ201504也在一个分支上，位于进化树的最上端，与其他病毒株有98.4%以上的同源性。这表明，DTMUV随着年份的变化，其氨基酸发生了一定的变化，但该变化是否引起DTMUV的抗原性或对鸭子的致病力的改变还需进一步通过动物回归实验进行验证。

本实验室对早期分离的DTMUV-FX2010研究较为深入，FX2010能够在DF-1细胞上良好增殖，通过肌肉和鼻腔两种接种途径接种均能够引起鸭子的全身性感染，在接种鸭的肝脏、脾脏、肺、肾脏和卵巢等脏器中都能分离到较高滴度的病毒，而且具有经空气传播给健康鸭的能力[16,17]。以FX2010作为对照，将ZJ201501和ZJ201504分别与FX2010进行序列比对分析，发现共有16个氨基酸位点的差异，其在C、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4B和NS5蛋白上分别有1、4、3、4、1、1、1和1个氨基酸位点差异。

C蛋白是黄病毒的衣壳蛋白，主要功能是保护核酸降解，诱发机体产生体液和细胞免疫。招募病毒RNA进行病毒组装和在病毒感染时释放RNA[18]。近期有研究发现JEV C-L66S位点的突变可导致病毒神经侵袭力的显著下降[19]。

E蛋白是黄病毒最重要的抗原蛋白，在病毒的吸附、病毒与细胞膜融合和病毒的包装中发挥重要作用[20,21]。E-N103K一个位点的突变就可导致日本乙型脑炎病毒基因型从3型到1型的转变[22]；WNV的E蛋白DⅠ-DⅡ铰链区T198F的突变就可以影响蛋白的结构稳定性，促使抗原决定簇暴露出来从而提高单克隆抗体中和的敏感性，对小鼠的致病性减弱[23]；JEV的E蛋白L107F、E138K、I176V、T177A、E244G、Q264H、K279M、A315V、S366A和K439R位点的突变能够显著降低JEV SA14-14-2 对小鼠神经毒力[19]。因此，本研究中DTMUV的E蛋白38、277、281、487位点的差异也有可能直接引起病毒致病力的改变。

NS1与感染早期病毒粒子的免疫入侵有关[24]，在病毒复制、感染和入侵时能够与宿主发生相互作用，形成一个疏水纤突，有助于病毒与细胞膜融合，该区域的氨基酸突变会影响病毒与细胞膜融合[25]。NS2A主要影响病毒RNA的合成，病毒的组装和抑制α/β干扰素反应[26]。JEV NS2A上的单点氨基酸改变能够影响病毒在体外的传播能力[27]。NS3与NS2B共同构成蛋白酶复合体，具有蛋白酶、RNA解旋酶、RNA聚合酶活性[28]。NS4B主要对病毒的复制和先天性免疫有重要的影响[29]。NS5具有甲基转移酶和RNA聚合酶活性，对病毒RNA 5'端加帽结构和病毒的复制有重要影响[30]。因此，非结构蛋白中的氨基酸变异，也可能对病毒RNA复制、病毒组装、释放等过程产生影响，从而影响病毒的生物学特性。

DTMUV属于单股正链RNA病毒，其核酸容易发生变异，从而导致编码的关键氨基酸变异，最终影响病毒的抗原性等改变。因此，对DTMUV进行流行病学调查、分离鉴定、序列分析等研究可以使我们及时掌握病毒的遗传进化信息，为有效、快速的对病毒的监测、防控提供理论基础，保护鸭养殖业的健康发展。

[1] 李泽君. 鸭坦布苏病毒病病原的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 中国家禽, 2011, 33(17): 34-35.

[2] Cao Z, Zhang C, Liu Y,et al.Tembusu virus in ducks,china[J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(10): 1873-1875.

[3] 曹贞贞, 张存, 黄瑜, 等. 鸭出血性卵巢炎的初步研究[J].中国兽医杂志, 2010, 46(12): 3-6.

[4] 胡旭东, 路浩, 刘培培, 等. 我国发现的一种引起鸭产蛋下降综合征的新型黄病毒[J]. 中国兽医杂志, 2011,47(7): 43-47.

[5] Yun T, Zhang D, Ma X,et al. Complete genome sequence of a novel Flavivirus, duck tembusu virus, isolated from ducks and geese in china[J]. J Virol, 2012, 86(6): 3406-3407.

[6] Zhou X, Zhang T, Song D,et al.Whole-genome sequence of Duck Tembusu virus strain DTMUV/CH/2014,isolated in China[J]. Genome Announc, 2016, 4(1): e01657-15.

[7] Yan Z, Shen H, Wang Z,et al. Isolation and characterization of a novel Tembusu virus circulating in muscovy ducks in south China[J]. Transbound Emerg Dis,2016, 4(2): 15-26

[8] Cao Z, Zhang C, Liu Y,et al. Tembusu virus in ducks,china[J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(10): 1873-1875.

[9] Su J, Li S, Hu X,et al. Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus, a New Tembusu-related Flavivirus[J].Plos One, 2011, 6(3): e18106.

[10] Yan P, Zhao Y, Zhang X,et al. An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China[J]. Virology, 2011, 417(1): 1-8.

[11] Liu M, Chen S, Chen Y,et al. Adapted Tembusu-like virus in chickens and geese in China[J]. Clin Microbiol,2012, 50(8): 2807-2809.

[12] Chen H, Liu X, Tang Y,et al. Complete genome sequences of two waterfowl-origin Tembusu virus strains isolated in Shandong province, China[J]. Genome Announc, 2013,1(6): 207-212.

[13] Sun X, Diao Y, Wang J,et al. Tembusu virus infection in Cherry Valley ducks: the effect of age at infection[J]. Vet Microbiol, 2014, 168(1): 16-24.

[14] Tang Y, Diao Y, Chen H,et al. Isolation and genetic characterization of a Tembusu virus strain isolated from mosquitoes in Shandong, China[J]. Transbound Emerg Dis, 2015, 62(2): 209-216.

[15] Lindenbach B D, Rice C M. Molecular biology of flaviviruses[J]. Adv Virus Res, 2003, 59: 23-61.

[16] Li G, Gao X, Xiao Y,et al. Development of a live attenuated vaccine candidate against duck Tembusu viral disease[J]. Virology, 2014, 450-451: 233-242.

[17] Li X, Shi Y, Liu Q,et al.Airborne transmission of a novel Tembusu virus in ducks[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(8):2734-2736.

[18] Byk L A, Gamarnik A V. Properties and functions of the Dengue virus Capsid protein[J]. Annu Rev Virol, 2016,3(1): 263-281.

[19] Gromowski G D, Firestone C Y, Whitehead S S. Genetic determinants of Japanese Encephalitis virus vaccine Strain SA14-14-2 that govern attenuation of virulence in mice[J]. J Virol, 2015, 89(12): 6328-6337.

[20] Mukhopadhyay S, Kuhn R J, Rossmann M G,et al. A structural perspective of the flavivirus life cycle[J]. Nat Rev Microbiol, 2005, 3(1): 13-22.

[21] Harris E, Holde, K L, Edgil D,et al. Molecular biology of flaviviruses[J]. Novartis Found Symp, 2006, 277(277):23.

[22] Banerjee S, Sen Gupta P S, Bandyopadhyay A K,et al.Insight into SNPs and epitopes of E protein of newly emerged genotype-I isolates of JEV from Midnapur, West Bengal, India[J]. BMC Immunol, 2017, 18(1): 13.

[23] Goo L, VanBlargan L A, Dowd K A,et al. A single mutation in the envelope protein modulates flavivirus antigenicity, stability, and pathogenesis[J]. Plos Patho ,2017, 13(2): e1006178.

[24] Thiemmeca S, Tamdet C, PunyadeeN,et al. Secreted NS1 protects Dengue virus from mannose-binding lectinmediated neutralization[J]. J Immunol, 2016, 197(10):15-25.

[25] Xu X, Song H, Qi J,et al. Contribution of intertwined loop to membrane association revealed by Zika virus fulllength NS1 structure[J]. Embo J, 2016, 35(20): 2170-2178.

[26] Kummerer B M, Rice C M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles[J]. J Virol, 2002,76(10): 4773-4784.

[27] Takamatsu Y, Morita K, Hayasaka D. A single amino acid substitution in the NS2A protein of Japanese Encephalitis virus affects virus propagation in vitro but not in vivo[J].J Virol, 2015, 89(11): 6126.

[28] Xu T, Sampath A, Chao A,et al. Structure of the Dengue virus helicase/nucleoside triphosphatase catalytic domain at a resolution of 2.4 A[J]. J Virol, 2005, 79(16):10278-10288.

[29] Li Y, Wong Y L, Lee M Y,et al. Secondary structure and membrane topology of the full-length Dengue virus NS4B in micelles[J]. Angew. Chem Int Ed Engl, 2016,55(39): 12068-12072.

[30] Ray D, Shah A, Tilgner M,et al.West Nile virus 5'-cap structure is formed by sequential guanine N-7 and ribose 2'-O methylations by nonstructural protein 5[J]. J Virol,2006, 80(17): 8362-8370.

ISOLATION AND COMPLETE GENOMIC SEQUENCE ANALYSIS OF DUCK TEMBUSU VIRUS

WANG Bin-bin, YAN Da-wei, NI Xin-tao, LI Xue-song, TENG Qiao-yang, YANG Jian-mei,CHEN Hong-jun, LIU Qin-fang, LI Ze-jun
(1.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai200241, China)

Two strains ZJ201501 and ZJ201504 of Duck Tembusu virus (DTMUV) were isolated on DF-1 cells from ovary samples of shelducks suspicious of infected DTMUV and confirmed in 2015 by RT-PCR. Each of 9 overlapping segments covering the whole genomes of ZJ201501 and ZJ201504 were amplified by PCR and sequenced. The strains ZJ201501 and ZJ201504 had 99.9% nucleotide homology but had two amino acids differences. Comparing with the 19 referance strains, these two strains shared more than 97.1%nucleotide homology and more than 98.4% amino acid homology for E proteins . However, both strains showed a far genetic distance from the strain FX2010, one of the earliest DTMUV isolates, indicating that in the past years DTMUVs varied to some degree in duck populations.

Duck Tembusu virus; isolation; genome sequencing; phylogenetic tree

2017-03-17

国家重点研发计划项目（2016YFD0500800）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31702237）；上海市自然科学基金项目（17ZR1437400）；上海市“科技创新行动计划”农业领域项目（17391901700）；河北省省级省校科技合作开发资金支持项目（坦布苏病毒ELISA抗体检测试剂盒的开发及产业化）；闵行区科技项目中小企业技术创新项目计划（2012110115569）；中央级公益性科研院所基本科研业务费项目（2017JB09）

王宾宾，女，硕士研究生，预防兽医学专业

李泽君，E-mail：lizejun@shvri.com.cn

S852.659.6

A

1674-6422（2017）06-0008-07