Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体在鸡体内的消长规律

于可响，侯艳霞，胡 峰，亓丽红，刘存霞，路 晓，黄 兵，宋敏训

（1.山东省农科院家禽研究所 山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室，济南 250023；2.烟台绿叶动物保健品有限公司，烟台 264003）

Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体在鸡体内的消长规律

于可响1，侯艳霞2，胡 峰1，亓丽红1，刘存霞1，路 晓1，黄 兵1，宋敏训1

（1.山东省农科院家禽研究所 山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室，济南 250023；2.烟台绿叶动物保健品有限公司，烟台 264003）

将Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体注射到SPF鸡体内，通过测定不同时间点鸡血清的抗体效价，确定卵黄抗体在体内的消长规律。结果发现，注射后6 h即可在实验鸡体内检测到较高水平的抗体，平均中和效价达到1:82，12 h抗体水平达到高峰，平均中和效价为1:124，然后逐渐降低，到12 d抗体平均效价降至1:13。卵黄抗体注射后3、6、9、12 d，利用Ⅰ群4型禽腺病毒进行攻毒试验，结果显示，抗体注射后6 d（体内平均中和抗体为1:36）能起到完全保护作用，9 d（体内平均中和抗体为1:22）只能产生部分保护作用，12 d（体内平均中和抗体为1:13）完全起不到保护作用。

Ⅰ群4型禽腺病毒；卵黄抗体；体内消长规律

自2015年6月份开始，我国大部分养鸡地区爆发了一种死亡快、死亡率高、剖检以心包积液和肝脏肿大、质脆、出血或坏死为主要病变特征的传染病，称为肝炎-心包积液综合征，又称安卡拉病。该病是由Ⅰ群血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus，FADV）引起，给我国养鸡业造成了极大经济损失[1-7]。

大量临床试验证明，血清4型禽腺病毒卵黄抗体对该病有很好的预防和治疗作用[8-13]。但抗体注射后，在鸡体内的消长变化情况目前还未见报道。本研究将血清4型禽腺病毒卵黄抗体注射到SPF鸡体内，通过测定不同时间点鸡血清的抗体效价，确定卵黄抗体在体内的消长规律，并通过攻毒试验确定抗体产生保护的临界值。

1 材料与方法

1.1 材料

动物保健品有限公司惠赠。Ⅰ群4型禽腺病毒由山东省农业科学院家禽研究所分离、保存。LMH细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠。SPF鸡胚、SPF鸡由山东昊泰实验动物繁育公司提供。

1.2 方法

1.2.1 Ⅰ群4型禽腺病毒细胞毒价测定 取冻存的LMH细胞加入到含10%胎牛血清的DMEM培养液进行复苏，4 h后换新的培养液继续培养至48 h，若生长良好，每瓶加入1 mL含EDTA的1%胰酶进行消化，待至细胞瓶边缘细胞滑落时，加适量含10%胎牛血清培养液吹散，分装96孔细胞板，继续培养，待长满单层后待用。将冻干保存的Ⅰ群4型禽腺病毒用含2%胎牛血清的DMEM培养液做10倍系列稀释，接种上述LMH细胞，200 μL/孔，每个稀释度接种8孔，同时设正常细胞对照。放37℃、CO2培养箱中继续培养，每天观察细胞，接种后96 h记录细胞病变情况，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。

1.2.2 Ⅰ群4型禽腺病毒半数致死量测定 将冻干保存的Ⅰ群4型禽腺病毒用生理盐水做10倍系列稀释，用10-2、10-3、10-4、10-5、10-6这5个稀释度的病毒分别通过肌肉注射接种21日龄禽腺病毒抗体阴性的SPF鸡，0.2 mL/只、各5只，观察记录实验鸡发病死亡情况，观察至接种后的10 d。按Reed-Muench法计算病

Ⅰ群4型禽腺病毒精制卵黄抗体由烟台绿叶毒的LD50。

1.2.3 Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体中和效价测定 取Ⅰ群4型禽腺病毒精制卵黄抗体先用生理盐水做10倍稀释，然后用含2%胎牛血清培养液做倍比稀释，然后加入到96孔细胞板中，0.1 mL/孔，然后将Ⅰ群4型禽腺病毒SH株用含2%胎牛血清培养液稀释到100 TCID50/0.1 mL，取0.1 mL加入到上述倍比稀释的抗体中，放37℃、CO2培养箱中作用1 h。96孔细胞板的LMH细胞长满单层后，弃掉培养液，将上述孵育后的混合液0.2 mL加入到细胞板中，同时将含100 TCID50/0.1 mL的病毒与等体积的含2%胎牛血清培养液混合作用1 h后，加入到细胞板中，作为病毒对照组，将只加2%胎牛血清培养液的细胞孔作为细胞对照组。上述各组各设8孔重复，放37℃、CO2培养箱中继续培养至96 h，观察并记录细胞病变。按照Reed-Muench法计算抗体的中和效价。

1.2.4 卵黄抗体在体内的消长规律与攻毒保护试验将Ⅰ群4型禽腺病毒精制卵黄抗体通过胸部肌肉注射21日龄禽腺病毒抗体阴性的SPF鸡，0.5 mL/只、共40只，标记其中10只用于采血，同时设阴性对照组，每只胸部肌肉注射生理盐水0.5 mL，共40只，标记其中10只用于采血。分别于注射后6、12、24 h、3 d、6 d、9 d、12 d采集试验组和对照组各10只鸡的血液并分离血清，按1.2.3中的方法测定血清的中和效价，绘制卵黄抗体在体内消长变化规律图。卵黄抗体注射后3 d、6 d、9 d、12 d分别取试验组和对照组各5只鸡，通过胸部肌肉注射Ⅰ群4型禽腺病毒，100 LD50/只，观察记录实验鸡发病死亡情况，观察至抗体注射后的10 d。

2 结果

2.1 Ⅰ群4型禽腺病毒细胞毒价测定

将冻干保存的Ⅰ群4型禽腺病毒做10倍系列稀释，在LMH细胞上进行毒价测定，每个稀释度8孔重复，接种后96 h统计细胞病变情况。按Reed-Muench法计算病毒的细胞毒价，结果为108.00TCID50/0.1 mL。

2.2 Ⅰ群4型禽腺病毒半数致死量测定

将冻干保存的Ⅰ群4型禽腺病毒做10倍系列稀释，接种21日龄禽腺病毒抗体阴性的SPF鸡，每个稀释度接种5只、观察10 d，记录实验鸡死亡情况，见表1。按Reed-Muench法测定病毒的半数致死量，结果为104.38LD50/0.2 mL。

表1 SPF鸡死亡情况统计Table 1 SPF chickens mortality statistics

2.3 Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体中和效价测定

将Ⅰ群4型禽腺病毒精制卵黄抗体做倍比稀释，在LMH细胞上进行中和效价测定，每个稀释度8孔重复，观察至96 h，记录细胞病变情况，见表2。按Reed-Muench法测定抗体的中和效价，结果为1:880。

表2 抗体中和试验细胞病变数量统计Table 2 The number of CEF statistics in antibody neutralization test

2.4 卵黄抗体在体内的消长规律与攻毒保护试验

卵黄抗体注射后6 h、12 h、24 h、3 d、6 d、9 d、12 d分别采集实验鸡的血清，利用细胞中和试验测定其中和效价，结果发现注射后6 h即可在实验鸡体内检测到较高水平的抗体，中和效价达到1:82，12 h抗体水平达到高峰，中和效价为1:124，然后逐渐降低，24 h、3 d、6 d、9 d、12 d的抗体效价分别为1:105、1:55、1:36、1:22、1:13，见图1。卵黄抗体注射后3 d、6 d、9 d、12 d对实验鸡进行攻毒，结果显示，抗体注射后3 d和6 d体内的抗体能起到完全保护作用，9 d有部分保护作用，到12 d无保护作用，见表3。死亡的实验鸡都具有心包积液、肝脏坏死出血等典型的Ⅰ群4型禽腺病毒致病特征。

图1 卵黄抗体在体内的消长规律Fig.1 Neutralization antibodies change curve of SPF chickens after yolk antibody injection

表3 攻毒后实验鸡死亡数量统计Table 3 Dead number statistics of test chickens after attacking

3 讨论

近两年肝炎-心包积液综合征的暴发给我国的养鸡业造成了极大的损失，目前已成为危害养鸡业的主要疫病之一。目前该病的药物治疗效果不佳，抗体注射效果最好，但抗体注射后在鸡体内的动态变化，以及产生保护的临界值目前还未见报道。本研究将细胞中和效价为1:880的Ⅰ群4型禽腺病毒精制卵黄抗体注射到21日龄SPF鸡体内，采集不同时间点实验鸡的血清，利用细胞中和试验测定其中和效价，结果发现，注射后12 h抗体水平达到高峰，然后逐渐降低，到12 d降至1:13。攻毒保护试验表明，注射后6 d中和抗体效价达到1:36时体内的抗体仍能起到完全保护作用，9 d中和抗体效价达到1:22时体内的抗体只能产生部分保护作用，到12 d无保护作用。

本研究将卵黄抗体注射到SPF鸡体内，通过中和试验确定了卵黄抗体在体内的消长规律，并通过攻毒试验确定了体内抗体产生保护的临界值，为卵黄抗体的临床治疗与紧急预防提供参考。

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DYNAMICS OF YOLK ANTIBODIES TO SEROTYPE 4 FOWL ADENOVIRUS IN CHICKENS

YU Ke-xiang1, HOU Yan-xia2, HU Feng1, QI Li-hong1, LIU Cun-xia1, LU Xiao1, HUANG Bing1,SONG Min-xun1
(1.Shandong Provincial Key Laboratory of Poultry Disease Diagnosis and Immunology, Institute of Poultry, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250023, China; 2. Yantai Greenery Animal Health Products inc., Yantai 264003, China)

The yolk antibodies to serotype 4 (Group I) Fowl adenovirus (FAV4) were injected into SPF chickens and antibody titers were detected in serum samples collected at different time points. The results showed higher levels of antibodies could be detected in the injected chickens at 6 h post injection and average neutralizing titer reached to 1:82. Antibody level peaked at 12 h post injection with titer of 1:124 and then gradually decreased to 1:13 at d12 post injection. At days 3, 6, 9, 12 days post injection, chickens were challenged with adenovirus. The average neutralizing antibody titer at 1:36 provided chickens for complete protection at 6 days post injection, 1:22 for partial protection at 9 days post injection, and 1:13 for no protection at 12 days post injection.

Serotype 4 Fowl adenovirus group I; yolk antibody; dynamics

2017-10-20

山东省农业科学院青年科研基金（2014QNM39）；国家重点研发计划（2016YFD0500800）；山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队计划（SDAIT-11-01）；山东省农业重大应用技术创新项目；山东省重点研发计划（2016GNC 110009）；山东省自然科学基金（ZR2015YL067）；山东省农业科学院创新工程项目（CXGC2016B14）

于可响，男，博士，副研究员，主要从事禽病研究

宋敏训，E-mail：mxsong@aliyun.com；黄兵， E-mail：hbind@163.com

S852.659.1

A

1674-6422（2017）06-0028-04