侧蒿挥发油化学成分及抗氧化、抑菌活性研究

张 彬， 邓樱花， 苏明伟， 张洪权

(湖北第二师范学院 化学与生命科学学院 植物抗癌活性物质提纯与应用湖北省重点实验室， 武汉 430205)

侧蒿挥发油化学成分及抗氧化、抑菌活性研究

张 彬*， 邓樱花， 苏明伟， 张洪权

(湖北第二师范学院 化学与生命科学学院 植物抗癌活性物质提纯与应用湖北省重点实验室， 武汉 430205)

采用同时蒸馏萃取法(SDE)提取侧蒿全草挥发油，通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术鉴定其中化学成分，采用峰面积归一化法确定各组分的相对百分含量，并对挥发油体外抗氧化活性和抑菌活性进行测试.采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法测定侧蒿挥发油体外抗氧化活性，以及其对5种供试菌的抑菌活性.结果表明：侧蒿挥发油共鉴定出37种化学成分，占总含量的76.93%，其中主要成分为石竹烯及其氧化物、桉树脑、樟脑、龙脑、萜品烯-4-醇、大根香叶烯D等.侧蒿挥发油对DPPH具有一定的清除能力，但清除效果弱于维生素C(Vc)；侧蒿挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉有较好的抑菌效果，最小抑菌浓度(MIC)分别为0.25 mg/mL、8.0 mg/mL、2.0 mg/mL.

侧蒿； 挥发油； 气相色谱-质谱； 抗氧化活性； 抑菌活性

蒿属，菊科一、二年生或多年生草本植物，全球约380种，广泛分布于北半球的温带地区，在我国有180余种[1]，全国均有分布.蒿属为我国传统的中药材，如艾蒿有散寒除湿、温经止血、安胎的功效，常用于功能性子宫出血、痛经、月经不调、先兆流产、湿疹等症；黄花蒿有清热凉血、退虚热、解暑、截疾的功效，常用于痢疾、伤暑潮热等症；茵陈蒿和滨蒿等则具清热利湿、利胆退黄、降血压等功效，临床上常用于黄疸型肝炎、胆囊炎和小便不利等；而牡蒿全草入药，具清热凉血解暑等功效，常用于感冒发热、中暑、肺结核潮热等[2].蒿属植物常有浓烈的挥发性香气，挥发油含量较高，其挥发油多具有抗菌消炎、平喘祛痰、驱寒止痛、通经活络、清热解毒等作用[3]，具有一定的临床药用价值，并在食品、香料及化妆品等领域也有广泛的应用价值.

侧蒿(ArtemisiadeversaDiels)，蒿属白苞蒿组，多年生草本植物，产于陕西南部、甘肃东南部、湖北西部及四川东北部等，生于海拔1 000～2 300 m地区林下、林缘、山谷、坡地及河边等[4].目前，国内外均未见侧蒿的相关研究报道，本文实验所用侧蒿采自湖北大别山主峰，首次对侧蒿挥发油进行化学成分鉴定及相对含量分析，并研究其抗氧化能力和抑菌能力，本研究拟为蒿属植物的深层次开发利用，以及湖北大别山地区植物的深入研究提供一定的实验依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 侧蒿样品 全株于2016年8月盛花期采于湖北省大别山主峰，海拔1 700 m坡地，由湖北第二师范学院化学与生命科学学院植物组教授戴月老师鉴定为侧蒿(ArtemisiadeversaDiels)新鲜全株.阴干、粉碎后备用.

1.1.2 实验试剂 正构烷烃C7～C30标准品，美国Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，上海阿拉丁试剂公司；其他所用试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水.

1.1.3 实验仪器 Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)；Agilent7890A气相色谱仪(美国Agilent公司)；酶标仪(美国Molecular Devices公司)；旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；同时蒸馏萃取仪(上海玻璃仪器厂)；电子天平(德国塞多利斯科学仪器)；高速多功能粉碎机(南京东迈科技有限公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 侧蒿挥发油的提取 电子天平称取200 g侧蒿粉末，置于5 L圆底烧瓶中，加入2.5 L超纯水，浸泡8 h.量取150 mL二氯甲烷，加入500 mL圆底烧瓶中，用蒸馏萃取仪萃取8 h.分出二氯甲烷层，加入无水硫酸钠，放置冰箱-20℃干燥过夜.过滤，旋转蒸发仪减压浓缩除去二氯甲烷，得侧蒿挥发油，密封，冰箱-20℃冷藏保存.

1.2.2 侧蒿挥发油的GC-MS分析 色谱条件：色谱柱为Agilent HP-5MS石英毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，初始温度60℃，保持3 min，以4℃/min升温至230℃并保持3 min.分流比30∶1，进样量1 μL.

质谱条件：离子源为FID；离子源温度：30℃；接口温度：150℃；电子能量：69.922 eV；电子倍增电压：2 164.7 V；溶剂延迟：3 min；扫描范围：30～500 amu；载气：He；定性分析：NIST11.L谱库检索；相对含量确定：峰面积归一化法.通过NIST质谱谱库数据及各组分保留指数与文献值对比，确定成分.

保留指数(rentention index，RI)的测定[5]：C7～C30正构烷烃标准品，在上述相同条件下进行GC-MS分析，测定其保留时间，根据线性公式计算出挥发油各组分的保留指数RI：RI=100n+100[tR(x)-tR(n)]/[tR(n+1)-tR(n)]，tR(x)为被分析的组分的保留时间，tR(n)和tR(n+1)分别为有n个和n+1个碳原子的正构烷烃的保留时间，且tR(n)

1.2.3 侧蒿挥发油1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)抗氧化活性测定 DPPH抗氧化活性测试根据Wang等[6]的方法，稍作调整.分别配制0.1 mM DPPH的甲醇溶液、10 mg/mL的VC和10 mg/mL挥发油的甲醇溶液，96孔板中加样，甲醇做空白对照，37℃避光孵化半个小时后，用酶标仪在517 nm波长测定其吸光度，运用如下公式计算样品对DPPH自由基的清除能力：

清除率I%=[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100%，

Asample为不同浓度的挥发油加DPPH后的吸光度，Ablank为不同浓度的挥发油不加DPPH的吸光度，Acontrol为不加挥发油的DPPH溶液的吸光度.

1.2.4 侧蒿挥发油的抑菌活性测定 菌悬液的配制[7]：供试菌用LB平板放置于37 ℃的培养箱中活化培养24 h后，挑取单菌落，于37 ℃在LB液体培养基中摇培24 h，将菌液浓度稀释到108cfu/mL备用.

侧蒿挥发油溶液的配制：以DMSO为溶剂，稀释法配制8个质量浓度梯度的侧蒿挥发油溶液，分别为32.0 mg/mL、16.0 mg/mL、8.0 mg/mL、4.0 mg/mL、2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL.

最低抑菌浓度(MIC)的测定：在超净工作台上，将灭菌的LB培养基倒入9 cm平板中，待培养基凝固后，加入50 μL 悬菌液，均匀涂布.待LB培养基凝固后打孔(孔径8 mm)，LB培养基封底，孔中加入50 μL挥发油溶液，移入培养箱，37℃下黑暗中培养24 h，观察供试菌生长情况，以无菌落生长的最低浓度为最低抑菌浓度MIC.以DMSO为空白对照、氨苄青霉素(AMP，最高浓度0.32 mg/mL)作阳性对照，每个菌种平行测定三次，最低抑菌浓度取平均值.

2 结果与分析

2.1 侧蒿挥发油化学成分分析

侧蒿挥发油总离子流图见图1.侧蒿挥发油组成成分及相对含量见表1.由表1可知，侧蒿挥发油中共鉴定37种成分，占挥发油总量的76.93%，其中主要成分为：石竹烯氧化物(13.72%)，桉树脑(12.2%)，樟脑(11.17%)，石竹烯(6.55%)，龙脑(3.12%)，萜品烯-4-醇(2.14%)，大根香叶烯D(2.14%)等.

2.2 侧蒿挥发油DPPH法抗氧化活性

DPPH法中，随着侧蒿挥发油浓度的增加，对DPPH自由基清除能力逐渐增强，其与Vc的DPPH自由基清除能力见图2和图3.由图可知，侧蒿挥发油对DPPH自由基具有一定的清除能力，对DPPH自由基清除率达到50%时，挥发油浓度为1 mg/mL，Vc的半抑制浓度(IC50)为2.5 μg/mL，侧蒿挥发油对DPPH自由基的清除能力明显低于Vc，可见侧蒿挥发油对DPPH的抗氧化活性较弱.

2.3 侧蒿挥发油的抑菌活性

通过对5种供试菌的抑菌活性测试，表明侧蒿挥发油对大肠杆菌、金色葡萄球菌、黑曲霉有一定的抑菌作用，对枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌没有明显的抑制作用.抑菌实验结果见表2，侧蒿挥发油对大肠杆菌的抑菌效果较好，最低抑菌浓度(MIC)为0.25 mg/mL，对黑曲霉、金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用，MIC分别为2.0 mg/mL 和8.0 mg/mL.侧蒿挥发油与AMP的最低抑菌浓度相比较，可以更直观的体现侧蒿挥发油的抑菌作用.

图1 同时蒸馏萃取法提取侧蒿挥发油总离子流图Fig.1 GC-MS total ion current chromatogram of volatile oil from Artemisia deversa Diels by SDE

No．percentagecontent/%CompoundnameFormulaMatchingdegree/%RIRIExpRIRef1034α⁃蒎烯(α⁃Pinene)C10H16979349312101莰烯(Camphene)C10H16979469453025β⁃蒎烯(β⁃Pinene)C10H169797497441551⁃辛烯⁃3⁃醇(1⁃Octen⁃3⁃ol)C8H16O9098198150562，3⁃脱氢⁃1，8⁃桉树脑(2，3⁃Dehydro⁃1，8⁃cineole)C10H16O909909906045α⁃萜品烯(α⁃Terpinene)C10H1695101610167031甲基异丙基苯(Cymene)C10H1497102510258122桉树脑(Eucalyptol)C10H18O98103010309043γ⁃萜品烯(γ⁃Terpinene)C10H11951058105810056顺式⁃氧化芳樟醇(cis⁃LinaloolOxide)C10H18O2591087108911072芳樟醇(Linalool)C10H18O9711021102121117樟脑(+)⁃2⁃BornanoneC10H16O971144114413312龙脑(endo⁃Borneol)C10H18O971166116614214萜品烯⁃4⁃醇(Terpinen⁃4⁃ol)C10H18O9311771177

续表1

注：RIExp为在HP-5MS 色谱柱上测定出来的相对于正构烷烃(C7～C30)的保留指数；RIRef为各化合物保留指数的文献值.

图2 侧蒿挥发油对 DPPH自由基的清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of volatile oil from Artemisia deversa Diels

图3 Vc对 DPPH自由基的清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging activity of Vc

表2 侧蒿挥发油对5种供试菌的MIC测定结果

3 讨论

通过GC-MS技术对大别山地区所产侧蒿的挥发油的化学成分进行鉴定分析，挥发油中绝大多数成分为萜烯类化合物及其含氧衍生物(72.39%)，与其他蒿属植物如青蒿[8]、艾蒿[9]、白莲蒿[10]等相比，与青蒿挥发油化学成分差异较大，仅有石竹烯、石竹烯氧化物、依兰烯、樟脑、桉树脑等5种化合物相同，且含量相差也较大.与白莲蒿、艾蒿挥发油化学成分类似，与白莲蒿化学成分相同的有：桉树脑、α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、α-松油醇、萜品烯-4-醇、乙酸龙脑酯、樟脑等8种化合物，其中桉树脑、樟脑含量均较高.与艾蒿化学成分相同的有：α-蒎烯、α-松油醇、石竹烯、石竹烯氧化物、桉树脑、樟脑、龙脑、大根香叶烯D、芳樟醇、斯巴醇、叶绿醇等11种化合物，其中石竹烯、石竹烯氧化物、桉树脑、樟脑、龙脑、大根香叶烯D等主要化学成分基本相同，含量接近.另外，侧蒿挥发油中其他成分如γ-萜品烯、β-金合欢烯、蛇麻烯、橙花叔醇等，也常出现在其他蒿属植物挥发油中.

侧蒿挥发油主要成分为石竹烯及其氧化物(20.27%)，桉树脑(12.2%)，樟脑(11.17%)，龙脑(3.12%)，萜品烯-4-醇(2.14%)，大根香叶烯D(2.14%).据文献报道，石竹烯及其氧化物、樟脑、龙脑、萜品烯-4-醇、均对细菌的细胞膜有破坏作用[11-15]，因此这些成分可能与侧蒿挥发油的抑菌活性有关.侧蒿挥发油中含有大量的萜烯、萜醇类成分，萜烯、萜醇类成分具有抗氧化功能，可能是其抗氧化活性的内在原因.侧蒿挥发油的研究，表明其具有一定的药学研究价值和作为食品天然抗氧化剂和抗菌剂的潜能，同时也为大别山地区植物生态的研究提供依据.

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Chemicalcompositionandantioxidant，antibacterialactivityof
volatileoilfromArtemisiadeversaDiels

ZHANG Bin， DENG Yinghua， SU Mingwei， ZHANG Hongquan

(College of Chemistry and Life Science， Hubei University of Education， Hubei Key Laboratory of Purification and Application of Plant Anti-Cancer Active Ingredients， Wuhan 430205， China)

The chemical composition， antimicrobial and antioxidant activities of the volatile oil ofArtemisiadeversaDiels were investigated. The composition of the volatile oil extracted by simultaneous distillation extraction (SDE) method， was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)， and a total of 37 components representing 76.93% in this plant were identified. The main constituents were Caryophyllene oxide (13.72%)， Eucalyptol (12.2%)， 2-Bornanone (11.17%)， Caryophyllene (6.55%)， endo-Borneol (3.12%)， Terpinen-4-ol (2.14%) and Germacrene D (2.14%). The antioxidant activity of the oil was evaluated by 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) method. The result showed that the oil revealed a certain scavenging effect on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical， and the inhibition increased with concentration of the oil increase. The antimicrobial activities of the oil were separately evaluated against five micro-organisms，Bacillussubtilis，Escherichiacoli，Staphylococcusaureus，BacilluscereusandAspergillusniger. The oil possessed inhibitory activity againstEscherichiacoli，StaphylococcusaureusandAspergillusnigerwith MIC of 0.25 mg/mL， 8.0 mg/mL and 2.0 mg/mL．

ArtemisiadeversaDiels; volatile oil; gas chromatography-mass spectrometry; antioxidant activity; antimicrobial activity

2017-07-20.

湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划(T201718)；湖北省教育厅科学技术研究项目(B2016219)； 植物抗癌活性物质提纯与应用湖北省重点实验室开放课题( HLPAI2014004).

*通讯联系人. E-mail: jaina96@163.com.

10.19603/j.cnki.1000-1190.2017.06.009

1000-1190(2017)06-0777-05

R284.2

A