补骨脂素对骨质疏松小鼠骨代谢指标和生物力学的影响

黄奎邹季*

补骨脂素对骨质疏松小鼠骨代谢指标和生物力学的影响

黄奎1,2邹季1*

目的利用卵巢切除小鼠模型，研究补骨脂素对骨质疏松小鼠骨代谢指标和股骨生物力学的影响。方法40只雌性 C57BL/6小鼠随机分为4组：假手术组（不切除卵巢+生理盐水），模型组（切除卵巢+生理盐水），雌二醇组（切除卵巢+雌二醇），补骨脂素组（切除卵巢+补骨脂素）。给药6周后测定血清碱性磷酸酶、I型胶原羧基末端肽和雌激素含量。利用3点弯曲实验对股骨生物力学进行检测。结果与模型组比较，补骨脂素组血清碱性磷酸酶水平升高，但无统计学差异，补骨脂素组和雌二醇组血清I型胶原羧基末端肽水平明显降低。雌二醇组血清雌激素水平较模型组明显升高，补骨脂素组血清雌激素水平仍保持较低水平，与模型组比较无统计学差异。与模型组比较，补骨脂素治疗组小鼠股骨的最大载荷，最大应力和弯曲弹性模量系数指标显著升高。结论补骨脂素作为一种天然植物雌激素可改善骨质疏松小鼠骨代谢指标和股骨生物力学性能。

补骨脂素；卵巢切除小鼠；骨代谢；生物力学

骨质疏松症是老年人和绝经后妇女常见疾病，以骨量减少、骨组织显微结构退化为特征，包括松质骨骨小梁变细、断裂、数量减少，皮质骨多孔、变薄，从而导致骨质脆性和骨折危险性增加的一种全身代谢性骨病。目前，应用传统中医药治疗骨质疏松症获得越来越多学者的关注。与现代合成的化学药物相比，传统中药来源广泛，价格便宜，使用时副反应更少[1]。补骨脂是补肾健骨制剂的主要成分之一，临床上常以补骨脂为主组方治疗肝肾不足型的骨质疏松症。补骨脂素是补骨脂中提取的一种有效活性成分，属于呋喃香豆素类化合物的植物雌激素。以往研究提示补骨脂素可促进骨髓间充质干细胞的增殖，并能诱导其向成骨细胞分化，在骨缺损处局部应用可促进成骨细胞增殖、增加骨的形成[2-3]。本实验通过观察补骨脂素对去卵巢小鼠骨代谢生化指标和生物力学的影响，探讨察补骨脂素对骨质疏松的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

40只9周龄雌性C57BL/6小鼠（购买于湖北省实验动物研究中心），体重（17.7±1.1）g，动物合格证号：SCXK（鄂）2015-0018，由长江大学实验动物房饲养。

1.2 动物分组

根据给药情况将40只小鼠随机分为4组：假手术组，模型组，雌二醇组，补骨脂素组。

1.3 试剂和主要仪器

补骨脂素（江苏永健医药公司），雌二醇（Sigma美国），10%水合氯醛（北京雷根生物技术有限公司），氨苄西林（华北制药厂），碱性磷酸酶ELISA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），I型胶原羧基末端肽ELISA检测试剂盒（武汉云克隆科技有限公司），雌激素ELISA检测试剂盒（北京北方生物技术研究所），生物力学测试机（Instron-8841美国）。

1.4 试验方法

1.4.1 骨质疏松小鼠造模

所有小鼠适应性喂养至12周龄，平均体重（20±0.19）g。模型组，雌二醇组和补骨脂组行双侧卵巢切除术，而假手术组仅切除卵巢周围少量脂肪组织。术后观察麻醉恢复，伤口愈合、进食和活动情况。

1.4.2 给药方法

根据以往临床应用和相关研究结果，并通过药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算公式，计算出补骨脂素应用的计量和溶度[4-7]。补骨脂素混悬于生理盐水中，制成4 mg/mL悬液。小鼠造模术后第3天，雌二醇组按0.1 mg/kg/d体重量灌胃，补骨脂素组按20mg/kg/d体重量灌胃，连续6周。假手术组和模型组以等剂量生理盐水灌胃。

1.4.3 标本采集时间点及检测方法

通过穿刺从小鼠心脏取出血液，并按常规分离制备血清，ELLISA试剂盒检测血清碱性磷酸酶（ALP）、I型胶原羧基末端肽（CTX-I）和雌激素含量。小鼠股骨生物力学检测：每组随机选取5只小鼠处死后取左侧股骨行3点弯曲测试。测量股骨横截面内外径的最大和最小值根据文献方法，计算出最大载荷，最大应力及弯曲弹性模量进行比较。

1.5 统计学方法

应用SPSS 19.0统计学软件（SPSS公司，美国）对所有资料进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠去卵巢术后和灌胃后一般情况观察

两组小鼠均在去卵巢术后3 h内苏醒。模型组和补骨脂素组分别有一只小鼠在术后第二天和第三天死亡，通过补充实验补齐。术后小鼠精神较差，进食、活动减少，术后第4天逐渐恢复。所有小鼠在灌胃后均正常进食，活动情况无异常。

2.2 补骨脂素对骨质疏松小鼠骨代谢生化指标的影响

图1 各组ALP水平柱状图注：*表示＜0.05假手术组与模型组对比=0.001；假手术组与补骨脂素组对比=0.000；模型组与雌二醇组对比=0.006。

图2 各组CTX-1水平柱状图注：*表示＜0.05CTX-1：假手术组与模型组对比=0.000；模型组与补骨脂素组对比=0.006；去卵巢组与雌二醇组对比=0.000。

图3 各组雌激素水平柱状图注：*表示＜0.05假手术组与模型组对比=0.000；模型组与雌二醇组对比=0.000。

2.3 补骨脂素对骨质疏松小鼠股骨生物力学指标的影响

模型组小鼠股骨的最大载荷，最大应力及弯曲弹性模量明显低于假手术组，补骨脂素组小鼠股骨的最大载荷，最大应力和弯曲弹性模量系数指标较模型组有显著升高（＜0.05），和雌二醇组比较无明显差异（＞0.05），但在最大应力指标上不及假手术组（＜0.05）（见表 1）。

表1 各组股骨生物力学指标

3 讨论

目前，已有大量研究证明，激素下降是造成绝经后妇女骨质流失的主要原因，结合在人类成骨细胞雌激素受体的发现，进一步说明雌激素的缺乏与绝经后骨质疏松症具有明确的因果关系。雌二醇是雌激素的主要成分被应用于骨质疏松症作为激素替代疗法，但同时因有可能引起乳腺癌、子宫异常出血和心血管并发症等限制了其在抗骨质疏松症治疗中的应用[8,9]。因此，新药研发者开始把研究方向转为相对安全、廉价、有效、不良反应小的植物雌激素（phytoestrogen），并已经成为全世界药物研究的热点[10-12]。

骨具有新陈代谢的活性，血清骨转换生化指标可以反映当前骨转换的状态，有助于对药物干预疗效的早期评估。生理状况下，ALP主要在成骨细胞质中合成并储存，是检测成骨细胞活性的可靠指标。本研究结果显示，给药6周后补骨脂素组血清ALP水平高于与模型组，提示补骨脂素可在在一定程度上增加成骨细胞的活性，使相对静止的成骨细胞转变为活跃的成骨细胞。王建华等[13]采用体外成骨细胞试验法，观察补骨脂素对大鼠成骨细胞的影响，结果认为补骨脂素可明显促进成骨细胞增殖和分化，并提高成骨细胞内碱性磷酸酶的活性。补骨脂素对成骨细胞影响的机制包括对和MAPK-NF-kB信号和BMPs信号通路的激活作用[14,15]。

I型胶原羧基末端肽是成熟型胶原降解时产生的一部分产物，在体内不能被降解和吸收，能直接反映骨胶原纤维的降解情况，被认为是反映骨吸收的最敏感和最特异的血液生化指标。本实验结果提示，补骨脂素和雌二醇类似，能明显降低骨质疏松状态下血清I型胶原羧基末端肽水平，提示补骨脂素能产生抑制骨吸收的效果，降低骨转换率。研究认为补骨脂素能发挥植物雌激素样作用对破骨细胞骨活性产生影响。研究发现[16]补骨脂素可通过抑制RANKL的表达来抑制破骨细胞的分化和成熟，从而抑制骨吸收。章文娟等[17]的研究结果显示，补骨脂素能显著抑制RANKL诱导小鼠单核/巨噬细胞发育成破骨细胞，抑制骨陷窝形成，其作用机制包括增强破骨细胞雌激素受体表达和抑制破骨细胞白细胞介素17R的表达。

本实验将雌二醇设为阳性对照组，结果提示小鼠口服补骨脂素6周后，并未引起雌激素水平的增加。这一结果与赵丕文等用小鼠子宫增重法筛选中药雌激素样作用的实验研究结果一致[18]。提示补骨脂素可能对雌激素受体选择性的发挥了作用，可较安全的应用于骨质疏松的治疗。

骨生物力学性能是判定骨组织质量不可或缺的主要指标，骨的“量”和“质”共同决定着骨的强度，即抵抗骨折的能力[19]。本研究对实验小鼠股骨行3点弯曲测试，结果表明小鼠去卵巢后股骨生物力学性能明显下降，而口服补骨脂素6周后小鼠股骨的结构力学参数和结构力学参数较模型组有明显改善，这可能与补骨脂素提高成骨细胞活性，并发挥植物雌激素作用来抑制破骨细胞和骨吸收有关。提示补骨脂素可减轻因雌激素降低骨质疏松对骨组织的破坏作用，优化骨骼结构力学性能，增强骨质量，降低骨折风险。

综上所述，补骨脂素作为一种天然植物雌激素可改善骨质疏松小鼠骨代谢指标和股骨生物力学性能。

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A study on the influence of psoralen on bone metabolism and biomechanics in ovariectomized mice

Huang Kui1,2, Zou Ji1.1 Hubei University of Chinese Medicine , Wuhan Hubei, 430065; 2 Department of Orthopaedics,The First Hospital of Yangtze University, Jingzhou Hubei, 434000, China

Objective To investigate the effect of psoralen on bone metabolism and biomechanics in ovariectomized (OVX) mice model. Methods A total of 40 mice were randomly divided into sham operation group (SHAM+NS), model group (OVX+NS), estradiol group (OVX+ estradiol) and psoralen group (OVX+ psoralen)，with 10 mouse in each group. After the medication for 6 weeks, blood was collected to assay serum alkaline phosphatase (ALP) , C-terminal crosslinking telopeptides of type I collagen (CTX-1) and estrogen. Biomechanics was studied using three-point bending test. Results Compared with the model group, the levels of ALP in psoralen group was increased but not significant, the level of CTX-1 were significantly decreased in estradiol group and psoralen group. Compared with the model group, level of estrogen was obviously increased in estradiol group but maintained a low level in psoralen group. Compared with the model group, the maximum load, maximum stress and flexure modulus were significantly increased. Conclusion Psoralen as a natural phytoestrogen promotes the bone metabolism and biomechanics in ovariectomized mice.

Psoralen;Ovariecto mized mice;Bone metabolism;Biomechanics

R282

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.06.003

swgk2017-07-00162

1湖北中医药大学，湖北武汉430065；2长江大学附属第一医院骨科，湖北荆州434000

黄奎（1981-）男，博士，副主任医师。研究方向：脊柱外科。

*[通讯作者]邹季（1950-）男，博士，主任医师。研究方向：中医骨伤。

2017-07-10）