短时受精失败或低受精率周期不同受精来源卵母细胞发育潜能比较

王 娜，李澎涛，邢 鹏，殷晨星

(河北省保定市妇幼保健院生殖中心，河北 保定 071000)

·论著·

短时受精失败或低受精率周期不同受精来源卵母细胞发育潜能比较

王 娜，李澎涛，邢 鹏，殷晨星

(河北省保定市妇幼保健院生殖中心，河北 保定 071000)

目的评估常规体外受精(in vitro fertilization，IVF)受精失败或低受精率周期中自然受精卵母细胞与补救受精卵母细胞受精后发育潜能及预后。方法对短时受精失败或低受精率的117个周期不孕症患者资料进行回顾分析，比较自然受精卵母细胞(A组)与补救受精卵母细胞(B组)受精后的异常受精率、2PN卵裂率、优质胚胎率、囊胚形成率、胚胎利用率、着床率、妊娠率及多胎妊娠率。结果A组优质胚胎率高于B组(P<0.05)；2组异常受精率、2PN卵裂率、囊胚形成率、胚胎利用率、着床率、妊娠率、多胎妊娠率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论对常规IVF短时受精失败或低受精率卵母细胞进行早补救卵胞浆内单精子注射可获得与自然受精卵母细胞相似的发育潜能及临床结局。

体外受精；胚胎移植；卵母细胞

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.026

体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET) 技术为众多不孕不育夫妇提供了一个新的、有效的治疗方法，与IVF相比短时受精可以明显提高临床妊娠率及胚胎种植率[1]，目前国外报道有10%～20%IVF周期受精完全失败或受精率<20%[2]，国内报道为3%～5%[3]。多种原因可以造成受精失败，男性生育能力下降，精卵结合能力降低或完全障碍是造成受精失败的首要原因；精卵结合障碍导致受精失败的另一重要原因是卵母细胞透明带表面缺乏精子受体[4]。在短时受精联合早补救卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术之前，晚补救即D1补救ICSI的受精率、妊娠率均很低，尤其抱婴回家率低。将补救ICSI的时间提前至加精后6 h，通过观察第二极体(2PB)是否释放判断受精，可明显提高卵子受精率、优质胚胎率及患者妊娠率。为比较短时受精失败或低受精率周期不同受精来源卵母细胞的发育潜能，本研究回顾分析行短时受精失败或受精率低于30%的低受精率周期，比较不同受精途径的胚胎继续发育的卵裂率、优质胚胎率、囊胚形成率、胚胎着床率及胚胎移植后的临床结局。报告如下。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 选择2013年3月—2016年5月我院生殖中心短时受精完全失败或低受精率117个周期所获卵1 438枚，1 103枚成熟卵母细胞，252枚卵子自然受精(自然受精卵母细胞组，A组)，972枚卵子进行早补救ICSI受精738枚(补救受精卵母细胞组，B组)。A组女方年龄(31.38±3.94)岁，B组女方年龄(29.67±4.00)岁。男方精液处理后前向运动精子总数≥1×106条，女方基础促卵泡激素<12 U/L。

1.2方法 卵子来源：女方采用常规长方案、短方案或超长方案降调, 重组人促卵泡生成素促卵泡生长。依据阴道B超和血激素值监测卵泡生长。当有4个以上>18 mm 卵泡时给予绒毛膜促性腺激素10 000 U，36 h 在超声引导下取卵。精子来源：男方禁欲3～7 d手淫取精，采用密度梯度-上游法收集精子。精卵共培养：获卵3.5 h后采用群受精法授精，受精浓度为10～30万/mL。精卵共孵育4 h，观察2PB释放。当2PB卵母细胞数为0判断为受精失败；当2PB卵母细胞数小于成熟卵母细胞总数的30%，需延长受精观察时间至加精后6 h，如仍未达到30%，判断为低受精率，即刻行补救性ICSI。补救受精后18 h观察原核。

胚胎评级：IVF第3天卵裂期胚胎评级，胚胎评级标准见表1。

表1 胚胎评级标准

胚胎选择：选择可移植及可冷冻胚胎，优先选择优质胚胎移植，剩余优质胚胎冷冻保存，非优质胚胎继续培养2～3 d，选择可冷冻的囊胚玻璃化冷冻保存。判断妊娠：胚胎移植后14 d检测血绒毛膜促性腺激素，移植后30 d阴道B超见宫内孕囊诊断为临床妊娠。

1.3观察指标 异常受精率=(1PN数+3PN数)/获MⅡ卵总数(1PN：一原核；3PN：三原核；MⅡ卵：无核，一个极体的卵母细胞)。2PN卵裂率=2PN卵裂总数/2PN数(2PN：二原核)。优质胚胎率=优质胚胎数/2PN卵裂数。囊胚形成率=囊胚数/囊胚培养数。胚胎利用率=冷冻胚胎数+移植胚胎数/卵裂胚胎总数。着床率=胎囊数(胚胎着床数)/移植胚胎总数。妊娠率=妊娠周期数/移植周期数。多胎妊娠率=多胎妊娠周期数/妊娠周期数。

1.4统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

A组优质胚胎率高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；2组异常受精率、2PN卵裂率、囊胚形成率、胚胎利用率差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1，2。

表1 2组观察指标结果比较 (%，胚胎数)

表2 2组胚胎移植后结局比较 (%，周期数)

3 讨 论

IVF-ET是指将同一不孕不育夫妇的卵子和精子取出体外在实验室的体外培养体系中使其自然结合、受精形成胚胎，并将胚胎移植到女性子宫内以实现妊娠的技术[5]。1978 年世界首例试管婴儿诞生，自此IVF技术经历了30多年的发展，仍不可避免受精失败这一难题[6]。IVF技术中，受精率直接影响后续临床妊娠结局，而影响受精率的因素很多[7]，因为受精是个纷繁复杂的过程，不仅包括精子的获能、精子穿过卵丘细胞和放射冠，而且还包括精子与卵母细胞透明带结合进而引发顶体反应、精子与卵母细胞融合、卵母细胞激活、雌雄原核形成等过程[8]，受精过程中任何一个环节发生障碍均可能导致受精失败。

目前在常规IVF-ET周期中受精失败是无法完全避免的，常规IVF发生受精失败的概率为5%～10%[9]，造成常规IVF低受精和完全不受精的原因尚不明确[10]。

受精失败的主要原因包括两类。①各种原因导致的精子无法进入卵母细胞：精子功能异常，未能成功穿过透明带进入卵母细胞；卵母细胞质量差，透明带增厚、变硬及精子结合位点的改变导致精子穿透障碍；不孕原因及技术因素。②卵母细胞激活失败即卵母细胞不能对精子诱导的激活产生反应和不能将精子核去浓缩形成雄原核，这类卵母细胞即使行ICSI操作，仍有2%～3%受精失败的可能[11]。

赵芳等[12-13]研究发现卵母细胞的成熟与否影响IVF受精率，对胚胎的质量也有重要影响，进而导致优质胚胎率降低，可利用胚胎数减少。Miyara等[14]发现常规IVF失败的卵母细胞中85.5%卵母细胞中未发现精子，显然精子未进入卵母细胞内。邓华丽等[15]报道不明原因不育夫妇原发不育者更容易出现IVF受精失败。本研究亦发现多年原发不育症患者容易出现受精失败，故对于这部分患者应多加关注，及时补救受精。Swain[16]研究发现培养体系的 pH值及其缓冲能力对配子及胚胎的质量有严重影响。 因此，认为IVF周期中合适的培养基pH值能够保证得到更好的临床妊娠结局[17]。

对受精失败的补救方法目前有2种，一是受精后20 h 补救ICSI(晚补救); 二是受精后6 h补救ICSI(早补救)。在短时受精结合早补救ICSI技术之前，大多采用晚补救ICSI,但其临床妊娠率极低，可能与卵子的老化有关。卵子的老化可能导致卵母细胞mRNA和蛋白质的减少,影响胚胎的发育,优胚率下降。正常情况下微丝主要存在于卵母细胞质的皮质区,微丝对减数分裂时纺锤体的迁移、旋转和原核的靠近起着重要作用,即使受精后有丝分裂纺锤体的行为也受微丝控制[18-19]，而老化的卵母细胞微丝排列被破坏[20]，故限制了其在临床中的应用。

自2003年短时受精结合早补救ICSI技术应用于临床，得到国内众多中心的认可及应用，在临床治疗效果上取得了与常规IVF受精相近的受精率、优质胚胎率及着床率[21，11]。短时受精结合早期补救性 ICSI 技术可较早地发现受精失败，早期进行ICSI补救，在很大程度上避免了完全受精失败的发生，故此项技术已被越来越多的生殖中心所采用[22]。赵芳等[12]的研究结果显示，短时受精联合早期ICSI可有效克服常规IVF受精障碍，显著提高受精率，获得良好的妊娠结局，因此可以作为临床挽救受精失败的最佳选择。

短时受精结合早补救虽然提高了受精率、妊娠率，但由于短时受精去除颗粒细胞时的机械刺激对透明带的损伤导致异常受精率亦明显增加[23]。同时因为2PB释放平均时间在受精后2 h 39 min,加精后6 h 90%受精卵释放极体，但让10%的卵母细胞未释放2PB导致判断失误[24]。本研究中受精失败补救ICSI部分的异常受精率虽然略高于自然受精部分，但差异无统计学意义。异常受精主要原因是个别卵母细胞虽然受精但2PB排除延迟，或者是对3级碎极体的判断失误而进行了补救ICSI，导致多精受精。但受精失败的自然受精仅10.21%，如果放弃对其补救受精将明显降低卵母细胞的利用率，对患者造成巨大的经济损失及精神压力。对于胚胎的利用上，对第3天的胚胎选择优质胚胎移植和冷冻，剩余所有胚胎继续囊胚培养，而对于没有优质胚胎的患者除移植胚胎外剩余胚胎皆囊胚培养。冼英杰等[25]的研究中继续培养非优质胚胎至囊胚期，从而有效挑选出哪些非优质胚胎具有发育潜能，尽管在此过程中一些可冷冻的非优质胚胎未发育成可冷冻囊胚而废弃，降低了胚胎利用率，造成胚胎浪费，但减少了患者不必要的解冻移植次数，提高了胚胎的移植效率，降低了患者经济压力。

本研究2组仅优质胚胎率差异有统计学意义，而移植自然受精组胚胎的临床妊娠率、着床率与移植补救ICSI组胚胎的数据差异无统计学意义。分析原因可能是由于移植自然受精组数据太少，结果的真实性有待更多的数据支持。

本研究也证实了早期补救的时间优势避免了卵子的过度老化，保证了胚胎发育与内膜种植的同步性，理论上有利于临床结局的改善。

综上所述，短时受精结合早补救ICSI是预防受精失败的有效方法，增加了胚胎利用率，减少了无胚胎移植的风险，挽救了部分受精失败，使这类患者的临床结局得到了很大改善。虽然早补救ICSI技术取得了良好的临床结局，没有明显增加安全性风险，但临床仍需大样本随访。

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2017-03-13；

2017-04-06

王娜(1977-),女,河北保定人，河北省保定市妇幼保健院主治医师，医学硕士，从事生殖医学研究。

R321.33

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1007-3205(2017)12-1464-04

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