SREBP-1在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

岳朝驰 杨向东

(西南医科大学附属医院肛肠科，四川 泸州 646000)

SREBP-1在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

岳朝驰 杨向东1

(西南医科大学附属医院肛肠科，四川 泸州 646000)

目的探讨固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1在结直肠癌中的表达特征及其与患者病情及预后的相关性。方法临床收集56例结直肠癌患者肿瘤组织及相应的癌旁组织，逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及免疫组化(IHC)技术检测组织中SREBP-1的表达，分析结直肠癌组织SREBP-1 mRNA的表达水平与患者年龄、体重、性别、肿瘤大小、临床Dukes分期及病理学分级的相关性，比较SREBP-1阳性率与患者临床资料间的关系，Kaplan-Meier生存分析法分析患者结直肠癌组织SREBP-1 mRNA的表达与预后的关系。结果RT-PCR结果显示结直肠癌组织SREBP-1 mRNA表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)，IHC的结果示结直肠癌组织中细胞SREBP-1阳性率显著高于癌旁组织(P<0.05)。Spearman相关性分析显示患者结直肠癌组织SREBP-1的表达与患者年龄、性别、体重及肿瘤大小无显著相关性(P>0.05)，与患者临床Dukes分期及病理学分级呈显著正相关(P<0.05)。kaplan-Meier生存分析示癌组织中高表达SREBP-1的患者预后不良。结论SREBP-1高表达于结直肠癌组织，且与肿瘤恶性程度、进展及患者不良预后密切相关，是潜在的结直肠癌标志物。

固醇调节元件结合蛋白；结直肠癌；Dukes分期；病理学分级

固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1是体内胆固醇浓度调节的关键分子，近年有研究显示，其参与肝细胞癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展〔1，2〕，但在结直肠癌中的作用尚不明确。本研究拟探究SREBP-1与结直肠癌患者临床资料及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取西南医科大学附属医院2013年2月至2014年9月入院的56例结直肠癌患者，均行根治性手术治疗，切除的手术组织标本送至病理科进行病理诊断及免疫组化，另取部分组织标本及癌旁组织(距癌变病灶>5 cm以上)置于液氮中保存，待抽提RNA行实时荧光定量PCR(RT-PCR)实验。其中男32例，女24例；年龄32～73〔平均(57.2±11.4)岁；体重42.0～76.0 kg，平均(62.2±8.9)kg；肿瘤原发灶最长径≥3 cm 25例，<3 cm 31例，平均(2.79±1.68)cm；患者Dukes分期及病理学分级均以国际抗癌联盟(UICC)和美国肿瘤联合会(ACS)联合制定的分期分级标准为依据〔2〕，其中Dukes A期12例，B期21例，C期17例，D期6例；根据腺管的形成比例评价患者的病理学分级：高分化结直肠癌(>95%腺管形成)23例，中分化(≥50%并≤95%腺管形成)17例，低分化(<50%腺管形成)16例。患者均为初发结直肠癌病例，未合并其他明显的器质性疾病，且入院前未经过任何形式的相关治疗。治疗后的患者进行随访观察2年。

1.2实验仪器及材料 实验仪器主要包括：PCR仪(美国Applied Biosystems)、超微量分光光度计(美国Nanodrop2000)、9700荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems)、超净工作台(美国Bio-Rad)、快速冷却离心机5810R(德国Eppendorf)、RM2235切片机(德国Leica Biosystems)、DM500光学显微镜(德国Leica Biosystems)，各规格吉尔森P型移液器(荷兰Pipetman)，陶瓷研磨器等。实验耗材：1.5 ml离心管、冻存管、PCR用8连管及各规格一次性移液枪枪头(美国Axygen Brand Products)，荧光定量96孔板及荧光定量96孔板(美国Applied Biosystems)等。实验试剂：RNAiso Plus (日本Takara)，RNA逆转录试剂盒(美国Fermentas)，定量PCR核酸荧光染料试剂盒(SYBR Green Supermix，美国Bio-Rad)，二甲苯、甲醇、无水乙醇、过氧化氢、氯仿及异丙醇等有机溶剂(国药集团化学试剂有限公司)，无核酸酶水(上海生工生物公司)，GTVisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(上海基因科技股份有限公司)等，实验抗体为抗SREBP-1抗体(ab28481，美国abcam)。

1.3实验方法

1.3.1逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 手术取出肿瘤组织及癌旁组织送病检，各留取20 mg组织-80℃保存，抽提RNA时在低温无核酶的条件下在研磨器中眼科剪尽量剪碎组织并研磨至细小组织块，研磨完成后在组织中加入1 ml RNAiso Plus，于冰上裂解5 min，12 000 r/min 4℃离心5 min，收集上清液置准备好的新离心管中，去除较大组织块，加入200 μl氯仿，震荡混匀后静置5 min，12 000 r/min 4℃离心15 min，收集上清液置准备好的新离心管中，加入1 ml异丙醇，室温静置10 min，去上清后75%乙醇清洗沉淀，7 500 r/min 4℃离心5 min，尽量吸去上清，室温下风干后30 μl无核酶水溶解。超微量分光光度计检测RNA浓度，取1 μg行逆转录，所有反应在冰上进行操作，将混合好的反应液1以3 μl/孔加入8连管中，加无核酶水至10 μl；42℃，配置反应液2，无核酶水定容至20 μl；37℃，15 min后85℃ 5 s，得到的cDNA稀释至500 μl。荧光实时定量PCR反应体系检测基因表达水平。反应条件：预变性 94℃ 4 min，扩增条件 94℃ 30 s，60℃ 1 min，共40个循环。SREBP-1产物大小226 bp：上游引物-GGGGACAAGGAATTCTCGGA，下游引物-TCACCACAGCTGTCAGAGAG，内参基因β-actin产物大小186 bp：上游引物-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC，下游引物-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT。

1.3.2免疫组化(IHC) 将切取的组织用固定液处理24 h，之后水化切片，将石蜡切片浸于二甲苯中10 min，取出切片置于无水乙醇中5 min，再置于90%、85%、80%、75%及70%梯度酒精中各3 min。0.3%过氧化氢(H2O2)处理切片10 min，用蒸馏水冲洗3次，切片放入抗原修复液中，放入高压锅中加热至沸腾，盖上压力阀至喷汽后持续4 min。修复完成后待切片自然冷却，蒸馏水冲洗5 min。37℃下干燥后，滴加3% H2O2于组织上，避光孵育15 min。蒸馏水冲洗5 min。滴加100 μl 1∶500 SREBP-1的一抗于组织上。室温孵育1 h，蒸馏水冲洗5 min，擦干组织周围的蒸馏水。滴加100 μl IHC试剂盒中的A液于组织上，室温孵育30 min，蒸馏水冲洗3次，每次5 min，擦干组织周围的蒸馏水。滴加100 μl显色剂二氨基联苯胺(DAB)溶液于组织上，室温孵育10 min，二级水冲洗终止显色。依次置于70%、75%、80%、85%、95%及100%乙醇中脱水，各3 min，脱水后浸于二甲苯中15 min，中性树封片。IHC染色切片采用光学显微镜进行观察，每张切片选取10个高倍视野，每个视野观察100个肿瘤细胞，计算平均阳性的细胞比例。以细胞核或细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性判断标准，无阳性细胞或阳性细胞<10%的为阴性(-)，≥10%为阳性(+)。

1.4统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t、χ2检验、Spearman秩相关检验和Kaplan-Meier生存分析法。

2 结 果

2.1SREBP-1在结直肠癌组织中的表达 结直肠癌组织中SREBP-1 mRNA相对表达量(0.185±0.010)显著高于癌旁正常组织(0.090±0.007，t=7.57，P<0.01)。结直肠癌细胞SREBP-1阳性率为51.8%(29/56)，显著高于癌旁正常组织的16.1%(9/56)(χ2=7.672，P<0.01)。见图1。

图1 结直肠癌组织与正常组织SREBP-1蛋白表达阳性率(×200)

2.2结直肠癌组织SREBP-1表达与患者一般资料的相关性 结直肠癌组织中SREBP-1 mRNA相对表达量与患者性别、年龄及体重均无相关性(rs=0.116、0.265、0.173，均P>0.05)。SREBP-1阳性患者与阴性患者性别、年龄及体重差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同结直肠癌组织SREBP-1蛋白表达水平患者一般资料比较〔n(%)〕

2.3结直肠癌组织SREBP-1表达水平与患者结直肠癌进展的相关性 结直肠癌组织中SREBP-1 mRNA相对表达量与患者肿瘤大小无相关性(rs=0.279，P>0.05)，但与临床Dukes分期及病理分级存在相关性(rs=0.574，0.522；P<0.01)。SREBP-1阳性患者与阴性患者肿瘤大小差异无统计学意义(P>0.05)，与Dukes分期及病理学分级有统计学差异(P<0.01，P<0.05)。见表2。

表2 不同结直肠癌组织SREBP-1蛋白表达水平患者临床病理资料比较〔n(%)〕

2.4结直肠癌组织SREBP-1表达水平与患者预后的关系 高表达SREBP-1患者(SREBP-1 mRNA表达水平高于平均值0.185)预后水平相比低表达患者显著不良(P<0.01)。见图2。

图2 结直肠癌组织SREBP-1 mRNA表达水平与患者生存时间的关系

3 讨 论

SREBP-1基因位于17p11.2染色体上，其编码的转录因子SREBP-1是体内关键的固醇调控分子，SREBP-1在细胞质中合成后进入细胞核与固醇调控元件(Sre1)结合，促进低密度脂蛋白胆固醇的形成，是脂代谢的重要组成部分〔3〕。随着恶性肿瘤与脂代谢的密切关系〔4〕逐渐引起人们的重视，SREBP-1被发现参与多种恶性肿瘤的发生发展：Bao等〔5〕的研究发现，SREBP-1在乳腺癌组织中高表达，其表达与乳腺癌的恶性程度及病情进展均呈显著正相关，且体外研究显示SREBP-1可促进乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7的增殖侵袭能力。Gibot等〔6〕发现他汀类药物降血脂的同时可通过阻断SREBP-1的效应，诱导胃癌细胞HGT-1的凋亡。刘洋等〔7〕发现SREBP-1在子宫内膜癌中高表达，其表达与患者年龄、临床分期及恶性程度呈显著正相关，且高表达SREBP-1的患者预后不良。Huang等〔8〕发现SREBP-1可通过增加活性氧(ROS)和表达NADPH氧化酶5(NOX5)诱导前列腺癌细胞氧化应激的发生，且SREBP-1表达与前列腺癌临床Gleason等级正相关，体外实验显示SREBP-1参与前列腺癌细胞的增殖、侵袭及细胞耐药。Li等〔9〕在肝细胞癌组织中也发现SREBP-1的高表达，其与患者肿瘤大小、临床分期、组织学分级及不良预后均呈显著正相关，其体外研究显示SREBP-1能明显促进肝癌细胞HepG2和MHCC97L的增殖及侵袭能力，并抑制其凋亡。Nie等〔10〕发现恶性卵巢癌中SREBP-1的阳性率显著高于良性和交界性卵巢肿瘤，体外使用短发夹RNA(shRNA)抑制卵巢癌细胞SREBP-1的表达后发现细胞增殖侵袭能力减弱，且凋亡增加；体内裸鼠移植瘤实验显示抑制SREBP-1可减弱卵巢癌细胞的成瘤能力。Geng等〔11〕发现固醇酰基转移酶(SOAT)-1可通过抑制SREBP-1抑制胶质瘤细胞的生长，Peng等〔12〕也发现SREBP-1在恶性胶质瘤细胞中高表达，且参与恶性胶质瘤的增殖。以上研究均表明SREBP-1在多种恶性肿瘤中异常表达，且与肿瘤的发生发展及肿瘤细胞的增殖、侵袭及凋亡存在密切关系，但其在结直肠癌中的表达特性及临床意义尚不明确。

本研究结果提示SREBP-1可能与促进结直肠癌细胞恶性行为的产生有关，SREBP-1可能通过促进结直肠癌细胞侵袭转移能力进而促进结直肠癌淋巴结或远处转移，并增强结直肠癌细胞恶性转化的程度，促进结直肠癌的发生发展，kaplan-Meier生存分析结果也进一步证实了SREBP-1在结直肠癌中的促癌效应，SREBP-1的高表达提示患者预后不良。但本研究并未明确SREBP-1与结直肠癌肿瘤大小的关系，未能为SREBP-1与结直肠癌增殖能力的关系提供线索，可能因为样本量较少，导致统计学差异不显著。

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R73

A

1005-9202(2017)23-5851-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.047

1 成都肛肠专科医院肛肠科

杨向东(1961-)，男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事肛肠疾病的中医药防治研究。

岳朝驰(1983-)，男，博士在读，主治医师，主要从事肛肠疾病的中医药防治研究。

〔2017-05-11修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)