G6PC基因在糖尿病患者中的表达及其与糖尿病肾病发生的相关性

宣国红 单平囡 茹金城 陈建江

(中国医科大学绍兴医院检验科，浙江 绍兴 312030)

G6PC基因在糖尿病患者中的表达及其与糖尿病肾病发生的相关性

宣国红 单平囡 茹金城 陈建江

(中国医科大学绍兴医院检验科，浙江 绍兴 312030)

目的探讨糖尿病(DM)患者外周血白细胞中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PC)基因的表达变化及其与糖尿病肾病(DN)发生的相关性。方法选取30例DM患者作为实验组(其中10例DN患者)，20例健康体检者为对照组，采用RT-PCR法检测DM患者外周血白细胞G6PC mRNA表达水平(以β-actin为内参)，同时比较DN患者与肾功能正常DM患者之间G6PC mRNA表达差异。结果与对照组比较，DM组患者G6PC的mRNA表达明显降低(0.65±0.19 vs 1.54±0.32，P<0.05)。DN组G6PC mRNA表达量显著低于肾功能正常DM组患者(P<0.05)。结论DM患者外周血白细胞G6PC基因表达下降，其可能在DN发生及进展中具有重要作用。

糖尿病;白细胞；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因

葡萄糖6磷酸酶(G6P)是人体葡糖糖代谢过程中重要的一种酶，也是糖异生和糖原分解过程中的限速酶，其活性及表达量的变化直接影响内生糖的输出，也直接与糖尿病(DM)的发生有关〔1，2〕。而G6P脱氢酶(G6PC)作为合成G6P的重要亚基，其表达能力的变化直接影响G6P的合成，也直接影响DM的发生。研究表明，可能受到肿瘤坏死因子(TNF)高表达的调控，糖尿病肾病(DN)患者白细胞中代谢酶基因的表达量下降，导致胰岛素刺激时细胞摄取葡萄糖能力降低，从而加重胰岛素抵抗，最终导致DM及其相关肾病的发生〔3〕。本研究探讨G6PC基因表达的变化及其在DM及DN发生发展机制中的作用。

1 材料与方法

1.1临床资料 收集绍兴医院2013～2014年收治的DN患者30例，均按1999年WHO糖尿病诊断及分型标准断：空腹血浆葡萄糖≥7.0 mmol/L或随机血浆葡萄糖≥11.1 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L，符合上述标准之一者，在次日复诊仍符合三条标准之一者确诊为DM患者，并排除与DM相关的其他内分泌疾病、肝胆疾病等，其中20例为肾功能正常患者，10例为DN患者(24 h尿白蛋白排泄率连续两次以上>30 mg/24 h)。20例对照组来自同期同年龄段健康体检人群，均排除DN、肾脏疾病、高脂血症、高血压及心脑血管疾病病史，均签订知情同意书，并通过医学伦理委员会同意。

1.2实验材料 TRIZOL试剂、无RNA酶的水(Invitrogen life technologies)；氯仿、异丙醇、100%乙醇、淋巴细胞分离液(上海化学试剂有限公司)；反转录试剂盒 (Invitrogen life technologies)，PCR仪(ABI公司)，高速离心机(贝克曼公司)。

1.3外周血白细胞的分离 将2 ml淋巴细胞分离液加入离心管中，取正常人或患者抗凝血液1 ml，加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)，混匀后小心加入淋巴细胞分离液上层，4 000 r/min离心15 min，离心后分为上层的血清，中间层的白细胞和下层的红细胞，吸取白细胞，加入2 ml PBS，吹打混匀，2 000 r/min离心5 min，去上清，1×107细胞加入1 ml TRIZOL试剂，反复吹打使细胞完全裂解，-80℃低温冰箱保存。

1.4RNA的提取及RT-PCR 分离的白细胞采用TRIZOL试剂提取RNA。紫外分光光度计测量RNA纯度，立即按照逆转录试剂盒进行逆转录反应，具体操作步骤参照说明书。G6PC基因序列上游引物5′- CATCGCCTGCGTTATCCTCA -3′,下游引物5′- CTGCAGTAGGTGGTTCTGCATC-3′,扩增片段453 bp；同时以β-actin为内参照物,上游引物5′- TGACGTGGACATCCGCAAAG -3′,下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG -3′,扩增片段208 bp。以上引物均由大连宝生物工程公司合成。PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳并与用凝胶成像仪(北京六一公司)成像及Image-Pro Plus软件对图像进行分析(以G6PC基因与β-actin的条带积分光密度比值表示其mRNA 的表达水平)。

1.5统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

DM组G6PC mRNA表达量(0.65±0.19)显著低于对照组(1.54±0.32，t=12.261，P=0.000)。DN组G6PC mRNA表达量(0.32±0.109)明显低于肾功能正常的DM患者(0.74±0.22，t=9.962，P=0.003)。见图1。

M:Marker;1,4:DN组；2，5：肾功能正常DM组；3，6：对照组图1 各组G6PC mRNA表达

3 讨 论

DM发病机制复杂，临床主要表现出高血糖的致病特点〔4〕。G6P是调节血糖代谢过程中的关键限速酶，它是一种结合膜蛋白系统，是位于内质网系统肝肾糖异生途径的最后步骤，G6PC的表达量直接影响G6P的表达量，从而影响葡萄糖的代谢，或而导致DM的发生〔5〕。此外，DN是DM患者常见的微血管并发症，是引起终末期肾脏疾病的主要病因。研究表明，DM患者近50%发生微量蛋白尿，近30%患者终末期会发生DN〔6〕。已有研究证实G6PC表达量降低与DN的发生发展相关〔7〕。DM时长期高血糖状态所诱发的机体代谢及血流动力学改变致使肾脏组织发生病理改变。主要表现为系膜增生、基底膜增厚、肾小球硬化，进而发展为DN。本研究发现DN患者外周血白细胞G6PC基因的表达量显著低于正常人DN患者G6PC表达量显著低于肾功能正常DM患者。这或许因DN患者微血管病变引起，而微血管病变是长期及持续性高血糖作用的结果。DN发生时，肾脏组织以系膜增生为主，而TNF则主要通过抑制G6PC等葡萄糖代谢酶基因转录，而导致胰岛素刺激细胞摄取葡萄糖能力降低，而促进DM及DN的发生〔8～10〕。

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3张 松,朱 琳,郝 军,等.血清TNF-α升高对糖尿病肾脏脂质积聚的影响研究〔J〕.中国药理学通报,2014;30(8):1161-5.

4方显锋,刘德敏,孙 颖,等.葡萄糖和木糖醇对葡萄糖6磷酸酶基因表达的调节作用〔J〕.天津医药,2005;33(1):30-2.

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6王兴盛.糖尿病肾病与糖尿病肾病合并非糖尿病肾病的病理及临床特征分析〔J〕.医学临床研究,2015;32(1):151-2.

7Abbadi S,Rodarte JJ,Abutaleb A,etal.Glucose-6-phosphatase is a key metabolic regulator of glioblastoma invasion〔J〕.Mol Cancer Res,2014;12(11):1547-59.

8林子桐,张 超,沈雪梅,等.糖尿病肾病发病机制研究进展〔J〕.中国药理学与毒理学杂志,2014;28(5):765-73.

9Zheng BX,Lin Q,Li M,etal.Three novel mutations of the G6PC gene identified in Chinese patients with glycogen storage disease type Ⅰa〔J〕.Eur J Pediatr,2015;174(1):59-63.

10刘栩晗,李国生,朱 华,等.小檗碱对2型糖尿病中国地鼠肝脏葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA表达的影响〔J〕.中国比较医学杂志,2008;18(4):9-13.

R587

A

1005-9202(2017)23-5843-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.043

陈建江(1968-)，男，副主任技师，主要从事糖尿病感染相关研究。

宣国红(1969-)，女，副主任技师，主要从事糖尿病相关基因研究。

〔2016-09-24修回〕

(编辑 曹梦园)