糖尿病足患者外周血T细胞的分化

刘 涛 戴黎明 李晓晶 朱宏涛

(三峡大学附属仁和医院手足显微外科，湖北 宜昌 443000)

糖尿病足患者外周血T细胞的分化

刘 涛 戴黎明 李晓晶 朱宏涛

(三峡大学附属仁和医院手足显微外科，湖北 宜昌 443000)

目的探讨糖尿病足(DFU)患者外周血中T细胞分化情况及其功能。方法采用流式细胞术分析DFU患者外周血中CD4+、CD8+T细胞亚群分布情况，包括初始T细胞、活化T细胞及效应T细胞；分析DFU患者外周血CD4+、CD8+T细胞迁移分子CC趋化因子受体(CCR)5、CCR4、CXC趋化因子受体(CXCR)3的表达情况；分析DFU患者外周血CD4+、CD8+T细胞分泌炎症因子干扰素(IFN)γ，白细胞介素(IL)2，肿瘤坏死因子(TNF)-α情况。结果与对照组比较，DFU患者外周血初始CD4+、CD8+T细胞比例显著降低，活化与效应T细胞比例显著升高(P<0.05)；迁移分子受体CCR4表达无显著差异(P>0.05)，CCR5与CXCR3表达在DFU患者中显著降低(P<0.05)；DFU患者中，炎症因子IFNγ在活化T细胞中高表达，在效应T细胞中几乎不表达，而IFNγ与TNF-α在效应T细胞中高表达，在初始T细胞中几乎不表达。结论DFU患者外周血T细胞亚群发生变化，其分泌的炎症因子影响了T细胞的免疫功能发挥。

糖尿病足；CD4+T细胞；CD8+T细胞；炎症

糖尿病足(DFU)引起的损伤与多种因素相关，包括神经损伤、微血管病变及免疫功能受损等〔1，2〕。目前治疗方法主要依赖于下肢截肢，加上一些治疗效果非常有限的新方法〔3〕。高血糖可以激活核转录因子(NF)-κB，从而破坏淋巴细胞激活与迁移〔4〕。相反，促炎因子如白细胞介素(IL)6，肿瘤坏死因子(TNF)-α被发现在DFU患者中加重胰岛素耐受〔5〕。尽管在DFU患者中发现有慢性炎症，然而DFU的免疫系统无法正常驱动有效的免疫应答，对抗病菌侵害与组织再生〔6〕。研究发现，DFU的创面难愈不仅由于体内有过量的促炎因子，并且还与抗感染因子的缺陷相关，如转化生长因子(TGF)-β，IL10等〔7〕。而在炎症与病菌耐受的平衡调控中，T细胞发挥重要的作用。在动物模型中发现，CD4+T细胞敲除对伤口愈合有负面影响，而CD8+T细胞的敲除有积极影响〔8〕。在DFU患者中，趋化环境与免疫细胞迁移的能力都发生了变化〔9〕，T细胞对于维持系统促炎环境有重要作用〔10〕。本文探究DFU患者免疫系统对伤口愈合的精确调控机制及外周血T细胞亚群的分布情况。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取三峡大学附属仁和医院2016年2～10月就诊的DFU患者52例，男28例，女24例，年龄35～78(平均54)岁，自愿参加本研究，研究前均未接受放射性治疗、化疗或其他治疗。年龄相匹配健康正常人为对照组48例，男25例，女23例，平均52岁。均获得受试者的书面同意书，经医院伦理委员会批准。仪器与试剂：细胞培养基〔RPMI，10%胎牛血清(FBS)，55 μmol/L 2-硫基乙醇，2 mmol/L L-谷氨酰胺，10 μg/ml谷氨酰胺，青霉素，链霉素〕;流式分析仪器：BD公司的Calibure。流式荧光抗体均购自Biolegend公司。

1.2方法

1.2.1外周血单个核细胞提取 取受试者25 ml外周血，采用Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)梯度离心。

1.2.2流式细胞术分析样品的制备

1.2.2.1细胞刺激 将分离得到的细胞重悬在1 ml细胞培养基中，加入25 ng/ml佛波酯(PMA)和1 μg/ml离子霉素，37℃细胞培养箱中刺激5 h后收集细胞分析。

1.2.2.2流式抗体标记 将细胞重悬在100 μl磷酸盐缓冲液(PBS)中，按照1×106细胞标3 μl流式抗体。置于4℃冰箱中避光孵育30 min，用1 ml PBS洗2次。后加入200 μl PBS上流式仪器分析。

1.3观察指标 (1)分析两组外周血中初始T细胞、活化T细胞、效应T细胞。(2)分析特异的皮肤迁移分子CC趋化因子受体(CCR)4的表达及早期炎症性Th1细胞特异的分子CCR5和CXC趋化因子受体(CXCR)3的表达情况。(3)分析T细胞亚群中主要的炎症性因子IL2，IFNγ，TNF-α表达情况。

1.4统计学方法 应用Graph Pad Prism 5.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组外周血中初始、活化与效应T细胞比较 DFU患者外周血中初始CD4+T细胞〔(19.8±2.2)%〕、CD8+T细胞〔(11.9±1.3)%〕比例显著低于对照组〔(42.3±5.5)%、(21.5±2.4)%,P<0.01〕。活化CD4+T细胞的比值〔(53.8±5.7)%〕显著高于对照组〔(18.4±2.1)%，P<0.05〕，CD8+T细胞〔(22.1±1.3)%、(21.7±1.8)%〕比较无统计学差异(P>0.05)。DFU患者效应CD4、CD8T细胞比例〔(18.6±1.8)%、(38.9±2.5)%〕显著高于对照组〔(8.4±1.2)%、(20.4±2.7)%，P<0.05〕。

2.2DFU患者T细胞趋化因子受体表达 CCR4主要表达于活化T细胞中，在CD4+T细胞中表达水平更高。两组CCR4表达无统计学差异(P>0.05)。CCR5与CXCR3主要表达在活化T细胞与效应T细胞中。DFU患者CCR5与CXCR3在CD4+与CD8+的效应T细胞中表达显著低于对照组(P<0.05)。见图1。

与DFU组比较：1)P<0.05图1 DFU患者T细胞趋化因子受体表达

2.3DFU患者外周血T细胞炎症因子分泌的变化 CD4+与CD8+中活化T细胞分泌的IL2〔(62.1±3.4)%、(54.6±2.7)%〕显著多于初始T细胞〔(40.2±2.9)%、(21.6±1.3)%，P<0.01〕。IFNγ与TNF-α在活化细胞与效应细胞中均高表达，且效应细胞中IFNγ〔(82.8±4.1)%、(81.7±4.6)%〕与TNF-α〔(82.3±6.1)%、(80.7±4.3)%〕表达均显著高于活化细胞〔(43.1±3.8)%、(56.2±4.3)%，(63.1±5.8)%、(59.2±3.3)%，P<0.01〕。

3 讨 论

早期有研究揭示了T细胞在创伤修复中炎症与增殖的双重作用，尽管创伤修复的损伤通常认为与CD8+T细胞的作用相关，然而关于T细胞亚群在创伤修复中的具体作用还有待被阐明〔11〕。本研究结果发现，DFU患者体内存在的促炎环境导致了初始T细胞亚群的显著性减少，同时伴随着不同阶段活化T细胞的积累。一些DFU患者在没有出现足部溃疡时，就已经出现了效应T细胞比例与数目的显著性增加。说明效应T细胞的积累是DFU患者中一个持续性的现象。

本研究结果发现，DFU患者中积累的效应T细胞，是炎症性因子IFNγ与TNF-α的主要来源，这些细胞因子反过来增强初始T细胞的激活与分化〔12〕。而且，活化T细胞通过产生低水平的IFN-γ与TNF-α也对系统性炎症环境的形成有作用。研究发现，在动物模型中，体内抑制TNF-α可以显著促进伤口愈合〔13〕。本研究结果提示，DFU患者持续积累的CD4+与CD8+效应T细胞可能与异常高表达INF-γ与TNF-α相关，可能导致了炎症性受体表达的下降，从而影响了T细胞迁移到发炎的组织中去。在免疫治疗策略上，可以通过降低T细胞活化与T细胞在组织中的积累降低DFU的病理性。

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8Mi Q，Riviere B，Clermont G，etal.Agent-based model of inflammation and wound healing：insights into diabetic foot ulcer pathology and the role of transforming growth factor-beta1〔J〕.Wound Repair Regen，2007；15(5)：671-82.

9Acosta JB，del Barco DG，Vera DC，etal.The pro-inflammatory environment in recalcitrant diabetic foot wounds〔J〕.Int Wound J，2008；5(4)：530-9.

10Bogdanski P，Pupek-Musialik D，Dytfeld J，etal.Influence of insulin therapy on expression of chemokine receptor CCR5 and selected inflammatory markers in patients with type 2 diabetes mellitus〔J〕.Int J Clin Pharmacol Ther，2007；45(6)：563-7.

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R587.2

A

1005-9202(2017)23-5839-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.041

戴黎明(1975-)，男，副主任医师，主要从事手足创伤修复、整形美容研究。

刘 涛(1979-)，男，主治医师，主要从事骨科研究。

〔2017-05-27修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)