氯吡格雷抵抗与血小板内皮聚集受体基因多态性的相关性

冯希振 王 雁

(青岛大学医学院，山东 青岛 266000)

氯吡格雷抵抗与血小板内皮聚集受体基因多态性的相关性

冯希振 王 雁1

(青岛大学医学院，山东 青岛 266000)

目的探讨血小板内皮聚集受体(PEAR)1基因单核苷酸多态性与缺血性脑卒中患者氯吡格雷抵抗(CR)的关系。方法纳入225例中国汉族缺血性脑卒中患者，服用100 mg阿司匹林及75 mg氯吡格雷双抗治疗7 d后，根据血栓弹力图(TEG)结果将其分为CR组和氯吡格雷敏感(CS)组。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法及直接测序法检测PEAR1基因的突变情况，利用多因素回归分析CR与PEAR1基因型及等位基因频率的关系。结果47例(20.9%)患者发生CR。PEAR1基因分布频率符合Hardy-Weinberg平衡定律，其中rs41273215位点CC基因型在CR组与CS组分布频率差异有统计学意义(P=0.021)，携带CC基因型比CT+TT基因型更易发生CR(OR=2.525，95%CI：1.300～4.905)，且C等位基因在CR组发生频率较CS组高1.695倍(OR=1.695，95%CI：1.046～2.746)。未发现rs3737224位点基因多态性与CR的相关性，SHEsis软件分析两基因位点间不存在连锁不平衡(D′=0.28;r2>0.06)，无法构建单倍型。多因素回归分析后，rs41273215位点CC基因型是CR独立危险因素(P=0.007，OR=2.802，95%CI：1.321～5.943)。结论PEAR1基因rs41273215位点C等位基因与中国汉族缺血性脑卒中患者CR的发生有关。

血小板内皮聚集受体基因；氯吡格雷抵抗；单核苷酸多态性

对于氯吡格雷抵抗(CR)的患者，调整用药剂量或更换药物仍有部分患者发生血小板聚集现象〔1～3〕。影响CR的因素混杂，发病机制不明确，目前已知的可能相关因素有患者的服药依从性，联合药物的应用，年龄，性别，体重指数，糖尿病等〔4〕。血小板内皮聚集受体(PEAR)1在2005年被Nanda等〔5〕鉴定为Ⅰ型膜蛋白在血小板和内皮细胞中高度表达，并且参与血小板聚集，通过促进血小板膜蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa介导的血小板黏附和聚集，促进血栓形成。目前国内外对于PEAR1基因多态性与CR关系报道少见，未发现有关PEAR1基因多态性与中国汉族人群缺血性脑卒中患者CR相关报道；本文拟对此做初步探究。

1 资料和方法

1.1研究对象 前瞻性连续收集2014年9月至2016年9月在青岛大学附属医院神经内科因缺血性脑卒中住院治疗的中国汉族患者225例，详细记录患者的临床资料、实验室检查结果和神经影像学资料。入组标准：(1)符合缺血性脑卒中疾病的诊断〔6〕及双抗治疗标准〔7〕；(2)双抗治疗(阿司匹林100 mg，氯吡格雷75 mg)7 d以上。排除标准：(1)近1个月内服用其他抗血小板药物或抗凝药；(2)1年内有活动性出血史，或伴有恶性肿瘤、血液病、胶原病；(3)血小板计数<100×109/L或>500×109/L；(4)肝、肾功能严重异常或凝血功能异常；(5)近期内接受过较大外科手术；(6)阿司匹林或氯吡格雷过敏者。参与者均知情同意。

1.2分组 研究对象均服用阿司匹林100 mg及氯吡格雷75 mg连续7 d，抽取外周静脉血，根据血栓弹力图(TEG)测定二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集率分为敏感组(CS：ADP抑制率≥30%)和抵抗组(CR：ADP抑制率<30%)〔8〕。

1.3基因检测 所有患者抽取外周静脉血3 ml，-20℃保存于乙二胺四乙酸(EDTA)管中，按照DNA提取试剂盒(Tiangen)说明书进行规范操作提取DNA，保存于-20℃。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)及直接测序法检测基因型。PCR反应体系：基因组DNA 2 μl，上下游引物各5 μl、2×Taq Mix 12.5 μl(北京艾德莱生物科技有限公司)加超纯水0.5 μl补至25 μl体系。PCR扩增条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s、58.5℃和59.5℃各30 s、72℃ 30 s；72℃ 5 min，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像检测PCR扩增产物，rs41273215正向5′-AGCTTGGAAGCCTTTGGTTGT-3′,反向5′-GGTAAGGGTTAAGTTGGAGGCA-3′,退火温度58.5℃，循环次数30次，内切酶 AcuⅠ，酶切片段TT：469 bp，CC：260，209 bp，CT：469，260，209 bp；rs3737224正向5′-TTAGCCTTCTGCTCCGCATC-3′，反向5′-GTCCAGCACTCACCGGAC-3′，退火温度59.5℃，循环次数30次，内切酶MspⅠ，酶切片段TT：351 bp，CC：211，140 bp，CT：351，211，140 bp。取上述PCR产物2 μl，内切酶1 μl，10×NEB缓冲液2 μl，灭菌离子双蒸水5 μl，反应总体积10 μl。37℃酶切至少1 h终止酶切反应。反应产物用2%琼脂糖凝胶，Gel red染色，140 V电压，300 mA电流稳压电泳40 min，凝胶系统成像，观察结果并照相。样本测序及PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t、χ2检验，单倍型分析用SHEsis软件在线分析；采用多因素Logistic回归分析。

2 结 果

2.1两组间一般资料比较 CR组47例，CS组178例。CR组女性、吸烟史、饮酒史频率及空腹血糖、高密度脂蛋白数值较CS组低(P<0.05)，但两组年龄、高血压、冠心病及低密度脂蛋白水平对比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2PEAR1的2个单核苷酸多态性(SNP)基因型和等位基因频率分布 PEAR1基因两位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群体代表性。两位点的扩增产物分别是469 bp，351 bp，两种基因位点均为CT多态，存在3种基因型：CC型，CT型，TT型。两位点的SNP酶切产物电泳图及测序结果见图1，图2。rs41273215位点CC基因型在CR组的分布明显高于CS组(χ2=7.750,P=0.005)，其C等位基因频率在CR组较CS组显示有较高的携带频率(OR=1.722，95%CI：1.046～2.786)；两组rs41273215的CC和CT+TT基因型比较差异有统计学意义(OR=2.525，95%CI：1.300～4.905)；两组rs3737224位点的3种基因型分布差异无统计学意义(OR=0.893，95%CI：0.462～1.727)，两组C等位基因频率差异无统计学意义(OR=0.783，95%CI：0.490～1.251)，见表2。

2.3多因素回归分析 rs41273215位点的CC基因型与脑血管病患者CR的发生呈显著相关(OR=2.802，95%CI：1.321～5.943)。女性及空腹血糖也是CR的独立危险因素。见表3。

M：Marker;1个条带为TT型(突变型)纯合子;2个条带为CC型(野生型)纯合子；3个条带为CT型杂合子图1 rs41273215、rs3737224位点的SNP酶切产物电泳图

A、B、C箭头所示分别是rs41273215位点的CC型、CT型、TT型图2 PEAR1基因测序图谱

表1 两组临床资料比较〔n(%)〕

表2 两组各位点等位基因频率及基因型分布特征〔n(%)〕

表3 氯吡格雷抵抗相关危险因素Logistic回归分析

3 讨 论

血小板的作用是正常止血的关键，也与血栓形成风险相关。已知PEAR1是最近发现的一种可以影响血小板聚集和内皮功能的血小板转运蛋白，其在循环的血小板表面低水平表达，在ADP、胶原相关肽(CRP-XL)及其他因素刺激下，PEAR1磷酸化进而表达上调，促进GPⅡb/Ⅲa介导的血小板聚集和黏附〔9〕，血小板膜糖蛋白GPⅢa 与GPⅡb 结合构成纤维蛋白原受体。GPⅡb/Ⅲa 活化并与纤维蛋白原结合是引起血小板聚集的最终共同途径参与血栓形成〔10〕。

本研究中CR的发生率与前人研究的结果相符〔9～11〕。本研究提示CC基因型可能与CR相关。本研究结果表明rs41273215的C等位基因的携带者较T等位基因携带者发生CR的概率增加。 Kim等〔11〕对健康中国人的研究发现口服普拉格雷相关的ADP诱导的血小板聚集与PEAR1的两基因位点rs41273215和rs3737224相关。Joshua等〔12〕调查研究了500例健康的北欧人，同样发现在其研究的PEAR1的14个基因多态性位点中，rs41273215和rs3737224两基因位点与血小板聚集有关，但rs3737224位点引起血小板聚集是通过CRP-XL而非ADP诱导，而入组病人均为接受ADP作为诱导剂，这可能是导致该位点与CR结果阴性的原因。

rs3737224基因位点位于基因编码的第12外显子区，而rs41273215位点位于基因编码的第15内含子区，推测该位点在内含子区可能作为增强子的结合位点来上调基因的表达。

目前关于PEAR1基因研究热点为同样位于内含子区的 rs12041331位点，其A等位基因携带者会显著增加心肌梗死的风险〔12〕。更新的研究表明，A等位基因显著影响内皮细胞的迁移，进而影响血栓形成〔13〕。而关于本研究涉及的两位点与临床危险事件的发生仍需进一步探究。有文献指出，采用VerifyNow发现阿司匹林服用会影响氯吡格雷的结果，但氯吡格雷对阿司匹林检测未见明显影响，而采用血小板血管扩张剂刺激磷蛋白的磷酸化(VASP-P)检测发现阿司匹林不会影响ADP诱导的血小板聚集〔14〕。另外，本实验研究中纳入的病例样本量有限，还需要进一步大样本多中心检测。

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R743.32

A

1005-9202(2017)23-5834-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.039

青岛大学附属医院课题(15-9-2-92-nsh)

1 青岛大学附属医院神经内科

王 雁(1968-)，女，主任医师，主要从事脑血管病、癫痫研究。

冯希振(1990-)，女，住院医师，主要从事脑血管病研究。

〔2017-06-11修回〕

(编辑 袁左鸣)