肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其与5-Fu联合用药对T-24细胞生长的抑制作用

肖建华 董自强 游 艳

(三峡大学第一临床医学院泌尿外科 三峡大学泌尿外科研究所，湖北 宜昌 443003)

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其与5-Fu联合用药对T-24细胞生长的抑制作用

肖建华 董自强 游 艳1

(三峡大学第一临床医学院泌尿外科 三峡大学泌尿外科研究所，湖北 宜昌 443003)

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)单独应用及其与传统化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)联合应用对体外培养人膀胱肿瘤T-24细胞生物学行为影响及可能机制。方法倒置显微镜下观察不同浓度TRAIL作用不同时间后T-24细胞形态变化；MTT法检测不同浓度TRAIL单独或10 ng/ml TRAIL联合不同浓度5-Fu不同时间后T-24细胞生存率；流式细胞仪检测T-24细胞凋亡率。结果TRAIL单独应用时对T-24细胞生长抑制作用有限，显微镜下部分细胞出现形态学改变，作用72 h后1、300、1 000 ng/ml组细胞生存率分别(92.52±3.60)%，(84.63±5.93)%和(79.45±2.04)%；单用200、400、600、800及1 000 μmol/ml 5-Fu时细胞生长抑制率分别为(10.76±1.78)%、(14.17±2.75)%、(28.01±1.66)%、(20.17±1.68)%和(32.53±3.65)%，联合10 ng/ml TRAIL处理后0、200、400、600、800及1 000 μmol/ml 5-Fu组细胞抑制率分别为分别为(3.85±0.88)%、(8.41±0.74)%、(16.39±2.72)%、(26.27±1.72)%、(28.99±3.36)%和(30.18±1.34)%；10、100、1 000 ng/ml TRAIL处理48 h后的细胞平均凋亡率为(3.75±0.31)%、(7.82±1.07)%、(7.78±3.15)%。结论TRAIL单用或联合其他化疗药物对T24细胞生长抑制作用有限，同5-Fu联合应用时不能明显增加T-24细胞对5-Fu的敏感性。

TRAIL；T-24；联合用药；生长抑制

目前以手术治疗为主的综合治疗是膀胱癌的主要治疗方法。任何保留膀胱的膀胱癌手术均存在复发可能，所以术后需定期做膀胱镜复查，化疗以预防膀胱癌的复发。而化疗药物常为一些毒性较高的药物，灌注后会出现诸如尿路刺激症状、血尿等药物毒副作用及厌食、恶心等胃肠道并发症，而即使早期膀胱肿瘤经尿道行肿瘤电切术后常规灌注化疗其复发率依然高达50%以上〔1〕。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)为肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员之一，参与身体自然防御，能诱导多种肿瘤细胞凋亡发生而对正常组织细胞的生长分化没有影响。同时，其还能增加多种肿瘤细胞对常用传统化疗药物的敏感性，或逆转部分肿瘤细胞的耐药性〔2〕，本文探讨TRAIL及其同5-氟尿嘧啶(5-Fu)联合应用对体外培养人膀胱癌T-24细胞生物学行为的影响。

1 材料和方法

1.1主要材料与试剂 TRAIL为美国Peprotech公司产品(货号：310-04，规格：50 μg/瓶)，5-Fu(上海浩然生物技术有限公司)、RPMI1640干粉、胰蛋白酶(武汉谷歌生物科技有限公司)、胎牛血清(杭州四季青)、抗生素(青霉素、链霉素，华北制药)、碳酸氢钠(天津市科密欧化学试剂有限公司)、医用级酒精(武汉市雪环医用消毒用品有限公司)、台盼蓝(北京市华美公司)，二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司产品，ANNEXIN V-FITC/PI 双染法细胞凋亡检测试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)，人膀胱癌T-24细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.2细胞培养 培养T-24细胞所用培养基采用其推荐的RPMI1640干粉溶于双蒸水配制，具体方法参照说明书完成。细胞用25 ml玻璃培养瓶置于37℃，5% CO2培养箱中培养，观察细胞的生长状态，2～3 d更换新鲜培养液，待显微镜下见细胞生长旺盛，必要时行细胞传代、冻存或收取细胞进行实验，所有过程确保为无菌操作。

1.3药物及试剂准备 不同浓度的TRAIL药液：用去离子水将TRAIL药物粉末溶解，然后用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液稀释至1、3、10、30、100、300、1 000 ng/ml及其他所需工作浓度；不同浓度的5-Fu药液：用高压灭菌后的双蒸水将药物粉末溶解，然后用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液将其稀释至200、400、600、800和1 000 μmol/ml。

1.4细胞形态观察 不同浓度药物作用期间定期观察不同分组细胞培养瓶中细胞的生长速度，胞体、胞核形态，培养液的颜色等，直观反映细胞生长状况的各项指标以确保实验顺利进行；预定时间处理完成后借助光学显微镜观察细胞生长抑制状况，初步判断其是否具有抑制人膀胱癌T-24细胞生长的作用。

1.5MTT法测定单用及联合用药时细胞生长抑制率 每96孔培养板上的加样分调零孔(等体积培养液)、阴性对照、不同浓度的实验药物三部分。细胞用胰酶消化，配成细胞悬液后接种到96孔板(每孔2×104个细胞)，放入培养箱中培养；细胞贴壁后施加处理因素。在不同的培养板中分别加入不同浓度TRAIL和5-Fu药液，每孔100 μl且每种浓度设置4个复孔；调零孔加入等体积的培养液，分别作用24，48和72 h。另分别配置不同浓度TRAIL和5-Fu混合药液，使得混合后的药液中5-Fu浓度分别为200、400、600、800、1 000 μmol/ml，而TRIAL浓度均为10 ng/ml。将混合药液按上述方法加入培养孔，每种浓度设置4个复孔，分别作用24，48和72 h。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡率 将生长状态良好的细胞用胰酶消化并配成细胞悬液，均匀种植到6孔培养板，设0、10、100、1 000 ng/ml四组。待其贴壁后进行换液，加入对应浓度的TRAIL药液；将培养板放入细胞培养箱，培养24 h后弃去药液，然后用胰酶消化细胞使其脱离培养板壁，用移液器吹打，转入离心管，800 r/min离心5 min后弃去上清；用磷酸盐缓冲液(PBS)反复洗涤三次，弃上清； 按ANNEXIN V-FITC/PI 双染法细胞凋亡检测试剂盒说明书配制缓冲液和染液，并对不同浓度药物处理后的细胞进行染色，染色时间为15 min；将按预定程序处理后的细胞上流式细胞仪进行凋亡检测。

1.7统计学方法 采用SPSS13.0软件进行方差LSD法Tamhane法检验。

2 结 果

2.1不同浓度TRAIL作用后的细胞形态学观察 阴性对照组细胞贴壁生长，状态良好，呈梭形，生长速度快，培养液清亮。而经不同浓度TRAIL处理后细胞的生长则受到轻度抑制，随着药物浓度增加，药物对细胞生长的抑制程度有一定的增加趋势，细胞体积稍变小，部分细胞的梭形变为不规则形状，部分贴壁细胞出现皱缩、变圆甚至脱落。见图1。

图1 不同浓度TRAIL处理24 h后T-24细胞的形态学观察(×40)

2.2不同浓度TRAIL和5-Fu对T-24细胞的生长抑制作用 不同浓度TRAIL作用24 h后对T-24细胞生长抑制最明显的为100 ng/ml组，所有浓度组细胞生存率均在80%以上；作用48 h后以1 000 ng/ml组对T-24细胞生长抑制程度最大。同一作用时间内，随着TRAIL 药物浓度的不断上升，细胞生长抑制程度呈现出逐渐上升的趋势(F=9.997，10.055，11.415；均P<0.01)，即TRAIL对T-24细胞生长抑制程度呈一定的浓度依赖性；当TRAIL药物浓度为1 ng/ml时，作用24 h，48 h和72 h后其对T-24细胞的生长抑制程度有一定差异(F=4.244，P<0.05)，其他浓度一定时(3，10，30，100，300，1 000 ng/ml)，作用不同时间后TRAIL对T-24细胞生长抑制程度并无明显差异(F=0.346，0.668，1.497，0.074，0.766，1.874；均P>0.05)。见表1。不同浓度5-Fu作用24 h后对T-24细胞生长抑制程度最大为1 000 μmol/ml组，其次为600 μmol/ml组；作用48 h 600、800和1 000 μmol/ml组细胞生存率均低于70%；作用72 h 1 000 μmol/ml组细胞生存率最低，其次为800 μmol/ml组，相同作用时间下，随着药物浓度不断上升，5-Fu对T-24细胞生长抑制程度呈现上升趋势，不同浓度组间存在显著差异(F=44.130，56.379，124.851；均P<0.01)；当5-Fu浓度为400 μmol/ml时，随着作用时间不断延长，其对T-24细胞生长抑制程度无明显差异(F=1.056，P=0.384)，当浓度为200，600，800和1 000 μmol/ml时，随着作用时间不断延长，5-Fu对T-24细胞生长抑制程度呈现出明显增强趋势(F=9.200，11.229，12.945，7.756；均P<0.05)，见表2。联合10 ng/ml TRAIL处理48 h后0、200、400、600、800、1 000 μmol/ml 5-Fu组T-24细胞生长抑制率分别为(3.85±0.88)%、(8.41±0.74)%、(16.39±2.72)%、(26.27±1.72)%、(28.99±3.36)%和(30.18±1.34)%，当5-Fu药物浓度为0(0)和800 μmol/ml〔(20.77±1.68)%〕时，联合10 ng/ml TRAIL细胞生长抑制率明显高于单用同浓度5-Fu组(t=75.324，22.024；均P<0.01)。200、400、600和1 000 μmol/ml 5-Fu单药处理〔(10.76±1.78)%、(14.17±2.75)%、(28.01±1.66)%、(32.53±3.65)%〕和联合TRAIL处理对细胞生长抑制程度并没有明显差异〔t=5.891，1.310，2.130，1.460；均P<0.05〕。

表1 不同浓度TRAIL对T-24细胞生存率的影响

与同时点其他浓度组比较：1)P<0.01；与同浓度前一时间点比较：2)P<0.05，下表同

表2 不同浓度5-Fu对T-24细胞生存率的影响

2.3TRAIL对T-24细胞凋亡率的影响 10、100、1 000 ng/ml TRAIL处理T-24细胞48 h后细胞凋亡率分别为(3.75±0.31)%、(7.82±1.07)%和(7.78±3.15)%，较0 ng/ml组稍增高但无统计学差异〔(1.41±0.51)%，F=4.399，P=0.067〕。

3 讨 论

当肿瘤细胞获取黏附并穿透脉管的能力后便可以从原发灶经循环系统向其他部位发生转移扩散，同时循环中的肿瘤细胞不时会受到如自然杀伤细胞等免疫细胞等发出的凋亡诱导信号作用而发生凋亡，二者激烈竞争决定肿瘤细胞的存活〔3〕。长期以来，各种抗肿瘤措施也主要是致力于凋亡诱导因素方面的研究而诞生，但事实上，尽管有众多凋亡诱导因素存在，肿瘤细胞仍然能够发生转移，引起高达90%的致死率，这就使得肿瘤的治疗一直成为人类难以克服的难题。TRAIL为TNF超家族的第三个成员，其基因位于3号染色体上，含有4个内含子和5个外显子，拥有众多生物学功能。研究表明TRAIL具有强大的抗肿瘤活性，却对正常组织细胞毒性极地，同时还参与机体的免疫调节、免疫自稳及免疫监视从而在一定程度上增强机体的免疫力，也可以起到一定的抗肿瘤作用〔4〕。本研究显示单独应用TRAIL对T-24细胞生长具有一定的抑制作用，但这种抑制作用有限，呈现出一定的浓度依赖性；结合凋亡率分析其诱导T-24细胞凋亡发生的能力有限，同5-Fu联合应用时在抑制T-24细胞生长方面同单用TRAIL相比并没有显著差异，但张少华等〔2〕研究证实TRAIL同顺铂联合应用时能明显提高卵巢癌细胞株CAOV3对药物的敏感性，这就表明TRAIL提高传统化疗药物敏感性的特点具有一定的细胞选择性，期待后续的实验选择其他膀胱癌细胞株系来探讨TRAIL的肿瘤细胞凋亡诱导能力和传统化疗药物的增敏性能。本实验证实新型抗肿瘤药物TRAIL对体外培养人膀胱癌T-24细胞的生长抑制作用和敏化5-Fu对T24细胞治疗效果的作用有限，其具体的机制还需要更深入研究予以探索，可能与T-24细胞表面TRAIL受体的表达情况有关〔5〕。但是，TRAIL优先诱导肿瘤细胞发生凋亡而不影响正常细胞的特性使其有望成为经典的肿瘤化疗药物。

1毛健伟，李庆文.肌层浸润性膀胱癌的治疗进展〔J〕.中华全科医学，2013；11(5)：778-80.

2张少华，杨筱凤，王 莉，等.TRAIL联合顺铂对卵巢癌细胞株CAOV3增殖抑制的实验研究〔J〕.山西医科大学学报，2014；45(5)：350-2.

3Li J，King MR.Adhesion receptors as therapeutic targets for circulating tumor cells〔J〕.Front Oncol,2012;2:79.

4许 飞，赵华善，魏云巍，等.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体肿瘤治疗研究进展〔J〕.中华临床医师杂志(电子版)，2013；7(5)：2157-60.

5田 梅，朴春姬，赵宝峰，等.可溶性人TRAIL基因表达载体的构建及其诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究〔J〕.中国老年学杂志，2006；26(11)：1495-7.

R73-3

A

1005-9202(2017)23-5796-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.020

1 三峡大学仁和医院

董自强(1964-)，男，教授，硕士生导师，主要从事泌尿外科常见疾病的诊治研究。

肖建华(1987-)，男，硕士，主治医师，主要从事泌尿外科肿瘤治疗研究。

〔2016-07-06修回〕

(编辑 曹梦园)