Salusin-β对心肌梗死大鼠凋亡及氧化应激的影响

蔡银链 徐 玲

(福建医科大学附属第二医院(泉州)心内二区，福建 泉州 362000)

Salusin-β对心肌梗死大鼠凋亡及氧化应激的影响

蔡银链 徐 玲

(福建医科大学附属第二医院(泉州)心内二区，福建 泉州 362000)

目的研究Salusin-β改善心肌梗死大鼠发病及相关凋亡及氧化应激机制。方法Wistar大鼠随机分为假手术组，模型组及治疗组(给予Salusin-β干预)，模型组和治疗组为心肌梗死模型大鼠。观察各组心功能、组织病理学改变、凋亡情况及氧化应激情况。结果假手术组相比，模型组及治疗组收缩压(SBP)、舒张压(DBP)及左室舒张压(LVSP)显著降低，左室舒张末压(LVEDP)显著升高(均P<0.05)；与模型组相比，治疗组SBP、DBP及LVSP显著升高，LVEDP显著降低(P均<0.05)。假手术组心肌组织细胞结构完整，肌纤维排列整齐；模型组细胞排列紊乱，水肿变形严重，肌纤维排列紊乱，间质充血水肿；治疗组病理学改变同模型组，但病变程度均减轻。假手术组基本不存在凋亡情况，模型组及治疗组凋亡情况显著增加；相比于模型组，治疗组凋亡显著降低。与假手术组相比，模型组及治疗组心肌组织Bcl-2蛋白表达显著降低，Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组相比，治疗组Bcl-2蛋白表达显著升高，Bax蛋白表达显著降低。与假手术组相比，模型组及治疗组SOD含量显著降低，MDA含量表达显著升高(均P<0.05)；与模型组相比，治疗组SOD含量显著升高，MDA含量表达显著降低(均P<0.05)。结论Salusin-β可通过改善心肌梗死大鼠心功能，抑制心肌细胞凋亡，改善心肌组织氧化应激从而发挥治疗心肌梗死疾病的作用。

Salusin-β；心肌梗死；Bcl-2；Bax；超氧化物歧化酶(SOD)；丙二醛(MDA)

心肌梗死致病机制复杂，至今未明确，细胞凋亡及多种氧化应激产物表达的失衡是造成机体损伤的重要机制〔1〕。Salusins具有心血管活性调节作用，在分子细胞水平方面，具有减轻心肌细胞钙超载、抗心肌细胞凋亡等作用，Salusins包括Salusin-α及Salusin-β〔2〕。实验报道〔3〕，Salusin-β可明显减少动物心肌缺血再灌注致恶性心律失常的发生，其是否可以通过调控体内凋亡及氧化应激的表达来改善疾病仍然未知。本文观察心肌梗死大鼠的发病情况及体外给予Salusin-β的作用机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 购自北京华阜康生物公司雄性Wistar大鼠120只，体重210～250 g，周龄8～10 w，随机分为假手术组模型组和治疗组各40只。其中模型组和治疗组均构建心肌梗死大鼠模型，治疗组给予10-8mol/L的Salusin-β(日本大阪肽研究所)腹腔注射干预，模型组给予同等剂量的生理盐水干预。

1.2动物模型构建 参考相关文献〔3〕，建立心肌梗死模型。大鼠乙醚麻醉后开胸。暴露胸腔后，在肺动脉圆锥与左心耳交界处，结扎左冠状动脉，采用心电监护显示ST 段抬高和( 或)T波抬高，提示心肌梗死模型构建成功。假手术组操作同上，仅暴露各组血管，而不进行线栓结扎。操作过程中无死亡率，存活率为100%。

1.3血流动力学检测 造模后2 w，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，剪开鼠头部皮肤，颈正中切口，分离右侧颈总动脉，然后颈总动脉和左心室插管，测定血压收缩压(SBP)、舒张压(DBP)及血流动力学指标左室舒张压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)。

1.4心肌组织病理形态检测 造模后2 w，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠处死，取心脏组织，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，包埋，切片后进行HE染色，光镜下观察心脏组织形态。

1.5原位末端标记法检测心肌细胞凋亡 将石蜡切片脱蜡，二甲苯透明，梯度酒精脱水，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，严格按照说明书原位末端标记法(北京鼎国有限公司)操作，清洗后封片显微镜观察。凋亡指数= (荧光细胞数/细胞总数)×100%。

1.6凋亡蛋白检测 取大鼠心脏组织，用小剪刀剪碎，加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，12 000 r/min，4℃，离心30 min取上清，应用蛋白定量检测蛋白浓度后，将各样品浓度配齐，并加入上样缓冲液煮沸变性。上样跑胶，转膜，封闭，加Bcl-2，Bax及内参β-actin一抗4℃过夜，第2天辣根过氧化物酶二抗常温孵育2 h，暗室内显影定影。

1.7超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测 造模后2 w，对大鼠进行眼球取血，静置2 h后高速离心取血清置于深冻冰箱备用。应用SOD、MDA试剂盒(碧云天试剂公司)，严格按照说明书及文献配置多种试剂及显色剂及操作〔3〕，SOD应用仪器检测吸光度。SOD(U/ml)=(对照管吸光度-测定管吸光度)/对照管吸光度×50%×稀释倍数。MDA采用荧光检测法，严格参照说明书及相关文献配置试剂及标准品〔3〕，试剂混匀后95℃水浴40 min，再流水冲洗，3 500 r/min离心10 min，取上清后测定吸光度。MDA(nmol/ml)=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度×稀释倍数。

1.8统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组心功能 与假手术组相比，模型组及治疗组SBP、DBP及LVSP显著降低(P<0.05)，LVEDP显著升高(P<0.05)；与模型组相比，治疗组SBP、DBP及LVSP显著升高(P<0.05)，LVEDP显著降低(P<0.05)，见表1。

2.2各组组织病理学 假手术组心肌组织细胞结构完整，肌纤维排列整齐；模型组细胞排列紊乱，水肿变形严重，肌纤维排列紊乱，间质充血水肿；治疗组病理学改变同模型组，但病变程度均减轻，见图1。

表1 各组心功能指标

与假手术组比较：1)P<0.05;与模型组比较：2)P<0.05；表2同

图1 各组心肌组织HE染色(×200)

2.3各组心肌细胞的凋亡 荧光显微镜图片中绿色荧光提示凋亡情况，假手术组基本不存在凋亡情况，模型组及治疗组凋亡情况显著增加；相比于模型组，治疗组凋亡显著降低，见图2。

图2 各组心肌细胞的凋亡(×200)

2.4各组凋亡蛋白表达 与假手术组相比，模型组及治疗组心肌组织Bcl-2蛋白表达显著降低，Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组相比，治疗组Bcl-2蛋白表达显著升高，Bax蛋白表达显著降低，见图3。

图3 各组凋亡蛋白表达

2.5各组SOD及MDA含量比较 与假手术组相比，模型组及治疗组SOD含量显著降低(P<0.05)，MDA含量表达显著升高(P<0.05)；与模型组相比，治疗组SOD含量显著升高(P<0.05)，MDA含量表达显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组SOD及MDA含量比较

3 讨 论

缺血缺氧导致的心肌组织及细胞的凋亡和坏死是疾病发生和发展的重要因素。已有研究表明，参与凋亡的机制有很多，其中线粒体作为重要的产能器官，多种凋亡蛋白可以诱发线粒体启动凋亡程序。并且，多种病理因素可以调控细胞内的Caspase-3，程序性细胞死亡因子(PDCD)-5及Bcl-2，Bax蛋白，诱导细胞的凋亡〔4,5〕。在众多凋亡蛋白中，Bax蛋白含量对细胞凋亡有正性加重作用，可诱导并促进细胞的凋亡。而Bcl-2蛋白具有抑制细胞凋亡的作用，可减轻体内凋亡情况〔6,7〕。Bcl-2及Bax蛋白是一对正负调节蛋白，互相作用调节机体内的凋亡情况。已有研究证实，急性心肌梗死患者体内Bcl-2蛋白含量降低，而Bax含量升高〔8〕，提示二者参与心肌梗死疾病的发生发展中。与此同时，机体在正常情况下可以清除体内多余的自由基，然而在心肌缺血缺氧的情况下，机体内会出现较多的氧自由基积聚，从而加重心肌组织损害。SOD是主要的抗氧化酶，能有效地清除体内自由基；而MDA与线粒体膜的稳定性呈负相关，因此通过测定两者情况可以评估机体内氧自由基水平〔9,10〕。

Salusins是日本学者利用生物信息学分析方法，于2003年从已经完成的人类基因组计划的基因文库中，根据表达序列标记的开放阅读框架预测的肽类物质中筛选出的新的生物活性肽。Salusins具有心血管活性调节作用，在分子细胞水平方面，具有减轻心肌细胞钙超载、抗心肌细胞凋亡等作用。本研究结果说明，Salusin-β可通过降低心肌细胞凋亡和改善体内氧化应激途径来减弱心肌梗死的发病。于芳等〔11〕研究提示，Salusin-β可能通过干预钙通道，促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路参与心肌生长发育过程，从而参与心肌梗死疾病中。王键飞等〔12〕研究提示Salusin-β可以显著减小大鼠心肌梗死区域，然而相关机制其并未阐明。本研究提示Salusin-β可通过降低心肌细胞凋亡和改善体内氧化应激途径来减弱心肌梗死的发生发展。

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11于 芳,赵 晶,杨靖辉,等.Salusins对大鼠离体心脏及心肌细胞的生物学效应的研究〔J〕.中国病理生理杂志,2004;20(6):913-8.

12王键飞,王 茵,单世富,等.Salusins通过减轻内质网应激保护缺血心肌〔J〕.中国科学:生命科学,2012;42 (6) :54-62.

R541.4

A

1005-9202(2017)23-5788-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.016

福建省卫生计生青年科研课题(2016-1-67)

徐 玲(1983-)，女，硕士，副主任医师，主要从事心电生理研究。

蔡银链(1983-)，男，硕士，主治医师，主要从事冠心病研究。

〔2016-11-25修回〕

(编辑 苑云杰)