糖尿病小鼠骨骼肌FoxO1及PPARγ的表达及意义

廖 鑫 陈其荣 阳 琰 高 琳 邓凡曲 张 晗 张 凌 牟芝群

(遵义医学院附属医院内分泌科，贵州 遵义 563003)

糖尿病小鼠骨骼肌FoxO1及PPARγ的表达及意义

廖 鑫 陈其荣 阳 琰 高 琳 邓凡曲1张 晗 张 凌 牟芝群

(遵义医学院附属医院内分泌科，贵州 遵义 563003)

目的观察KKAy糖尿病小鼠骨骼肌组织中叉头状因子(Fox)O1、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ的表达,探讨FoxO1的表达与糖脂代谢的关系。方法8周龄KKAy小鼠8只为糖尿病模型组(DM)，予以高脂饲料喂养；8周龄C57BL/6J小鼠16只，随机分为空白对照组(NC)8只、高脂喂养组(HFD)8只。喂养至16 w后检测3组小鼠空腹血糖(FBG)、胰岛素(Ins)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)；采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测骨骼肌组织FoxO1及PPARγ mRNA表达，Western印迹检测骨骼肌组织中FoxO1蛋白表达。结果DM组FBG、TG、TC、LDL-C、Ins和HOMA-IR水平均较NC组及HFD组显著升高(P<0.05)，HFD组小鼠Ins、TC、LDL-C和HOMA-IR较NC组显著升高(P<0.05)；DM组PPARγ mRNA较NC组及HFD组均显著降低(P<0.01)，HFD组PPARγ mRNA较NC组显著降低(P<0.05)；DM组FoxO1 mRNA及蛋白表达较NC组及HFD组均明显增高(P<0.05)。DM组骨骼肌FoxO1 mRNA表达与FBG(r=0.910,P<0.01)、Ins(r=0.864,P<0.01)、TG(r=0.897,P<0.01)和HOMA-IR(r=0.944,P<0.01)呈正相关，与PPARγ mRNA呈负相关(r=-0.719,P<0.01)。结论FoxO1的表达与糖血脂代谢密切相关。

叉头状因子O1；糖尿病；过氧化物酶体增殖物激活受体

近年研究显示，胰岛素抵抗及糖尿病发生发展与叉头状因子(Fox)O1相关〔1，2〕,其在肝脏通过增加葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-pase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)表达而使肝脏糖异生增加，可以使β细胞去分化〔3〕；在脂肪组组织，FoxO1 通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ的表达阻止脂肪细胞分化，进一步导致胰岛素抵抗〔4〕；FoxO1可上调骨骼肌组织丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)4基因表达,减少糖利用，导致胰岛素抵抗〔2〕。然而目前有关FoxO1在糖代谢中的作用机制并未完全阐明。本文采用KKAy糖尿病小鼠模型,观察其骨骼肌组织中PPARγ、FoxO1 mRNA及蛋白表达变化。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级雄性KKAy小鼠，体重约30 g，8周龄；同周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重约20 g，均由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，许可证号：SCXK(京)2009-0004。C57BL/6J小鼠16只，根据饲料不同随机分为空白对照组(NC)8只和高脂喂养组(HFD)8只。KKAy小鼠8只，予专用高脂饲料喂养至16 w后，断尾取血测空腹血糖(FBG)(强生稳豪倍优型血糖仪)，2次FBG均≥13.9 mmol/L为糖尿病模型，8只全部成模。麻醉后眼球取血并取骨骼肌标本及血清，-80℃冰箱冻存。全自动生化分析仪(Olympus AU2700型)检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清胰岛素(Ins,美国RD公司)。稳态模型的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=(FBG×Ins)/22.5，胰岛素敏感指数(ISI)=1/FBG×Ins。

1.2方法

1.2.1RT-PCR检测FoxO1及PPARγ mRNA的表达 腹腔注射水合氯醛麻醉后，取骨骼肌组织约100 mg置于800 μl Trizol中，-80℃冰箱冻存。提取骨骼肌组织总RNA并逆转录为cDNA，引物由宝生物公司合成(β-actin上游引物CATCCgTAAAgACCTCTATgCCAAC，下游引物TggAgCCACCgATCCACA；FoxO1上游引物GCACAGTGAACTCCAGGAAAGG，下游引物CACCAAAGGAAATGAATCAAACAAG；PPARγ上游引物AGACAAGACCAGTGAACTAAGGGAT，下游引物AGGAAGAGCAAGAAGGCGACA)；采用BIO-RAD公司icycler荧光定量PCR仪测定。反应条件：95.0℃×3 min；95.0℃×10 s，60.0℃×45 s，40个循环。

1.2.2Western印迹检测FoxO1 蛋白表达 ①组织总蛋白提取及定量：取少量骨骼肌冰上剪碎后加细胞裂解液匀浆，离心，取上清，并用BCA法测定组织蛋白浓度。②聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：变性，取上清液加入5倍上样缓冲液混匀，95℃加热变性5 min；制备10%的分离胶及5%的浓缩胶，电泳完毕采用湿转法，将蛋白转移到PVDF膜上，PVDF膜与一抗FoxO1(1∶1 000，Abcam公司)结合过夜，次日洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶2 000，碧云天公司)，室温孵育1 h,采用增强化学发光法显色，在BIO-RAD凝胶成像仪中曝光，结果采用Quantity One定量分析系统进行灰度测定。

1.3统计学处理 应用SPSS19.0软件，多组间数据比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，相关性采用Pearson相关分析。

2 结 果

2.1小鼠代谢指标比较 DM组TG、TC、HDL-C、LDL-C、FBG、Ins及HOMA-IR水平较NC组及HFD组明显升高(P<0.05，P<0.01)，ISI明显降低(P<0.01)；与NC组比较，HFD组TC、HDL-C、LDL-C及HOMA-IR水平均明显升高(P<0.05，P<0.01)，ISI明显降低(P<0.05)，见表1。

2.2FoxO1及PPARγ mRNA表达 DM组骨骼肌FoxO1 mRNA表达量(48.47±2.46)较NC组(18.26±2.49)、HFD组(20.00±2.06)明显增高(P<0.01)，PPARγ mRNA表达量(0.50±0.03)较NC组(1.61±0.15)、HFD组(0.73±0.03)明显降低(P<0.05)。

表1 三组小鼠代谢指标比较

与NC组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与HFD组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

2.3FoxO1 蛋白表达 DM组骨骼肌FoxO1 蛋白表达(4.73±0.79)较NC组(0.91±0.17)、HFD组(1.26±0.16)明显增高(P<0.05)，见图1。

图1 Western印迹检测FoxO1 蛋白表达

2.4FoxO1 mRNA与生化指标及PPARγ相关性 FoxO1 与PPARγ呈负相关(r=-0.719，P<0.01)，与TG、TC、LDL-C,FBG、Ins、 HOMA-IR显性正相关(r分别为0.897、0.903、0.840、0.910、0.864、0.944，均P<0.01)，与ISI负相关(r=-0.929，P<0.01)。

3 讨 论

FoxO1 是胰岛素信号通路中下游的关键信号分子，其上游主要受磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)调控〔2〕。FoxO1 位于细胞核内,能够促进细胞内葡萄糖合成关键酶的合成，胰岛素激活PI3K/Akt途径可使FoxO1 转录因子磷酸化而移出细胞核,阻断其促进葡萄糖合成酶的作用。近年研究表明，FOX已经成为一种新的能量代谢的调节器和胰岛素信号靶点〔5〕。

本实验数据显示FoxO1增加使胰岛素敏感性降低，胰岛素抵抗加重，这一研究显示FoxO1参与了胰岛素抵抗的发展。FoxO1在骨骼肌糖代谢调节中有一定作用，其调节骨骼肌糖代谢与丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)4有关，PDK4可刺激丙酮酸脱氢酶(PDC)磷酸化，从而降低丙酮酸脱氢酶的活性，减少丙酮酸进入三羧酸循环，降低饥饿时机体对糖的利用。有研究发现，在C2C12细胞中,PDK4结合于FoxO1基因启动子区域从而使其表达上调〔2〕。Kousteni〔6〕提出，饥饿状态下，FoxO1通过分解肌肉蛋白质提供能量供应，导致肌肉损耗和萎缩，进一步造成胰岛素抵抗。同时，胰岛素抵抗时PI3k/Akt受损，FoxO1未被磷酸化，从而核内FoxO1增多，导致血糖进一步升高。

FoxO1与PPARγ均为调节胰岛素敏感性及葡萄糖代谢的重要转录因子，能调节葡萄糖转运子(GLUT)-4的表达。Kim等〔7〕敲除FoxO1 基因可增加骨骼肌、肝脏胰岛素敏感性，并且使PPARγ及其相关基因表达增加，并从体内、外水平证明FoxO1对 PPARγ的抑制。此后，Gupta等〔8〕证实FoxO1通过抑制胰腺十二指肠同源盒(PDX)-1的表达，进一步抑制PPARγ表达，导致胰岛素抵抗。FoxO1 与血脂的代谢有关，可诱导骨骼肌中LPL基因表达增加，LPL可能是FoxO1在骨骼肌调节脂质代谢的靶点，骨骼肌高水平的LPL进一步引起胰岛素抵抗〔9〕。FoxO1选择性抑制剂AS1708727〔10〕、AS1842856〔11〕可以剂量依赖性地改善血脂异常，降低血糖。综上，FoxO1参与胰岛素抵抗及糖尿病发生发展，调控骨骼肌FoxO1的表达可能成为改善糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗的治疗靶点。

1Kumashiro N,Beddow SA,Vatner DF,etal.Targeting pyruvate carboxylase reduces gluconeogenesis and adiposity and improves insulin resistance〔J〕.Diabetes,2013;62(7):2183-94.

2Sanchez AMJ,Candau RB,Bernardi H.FoxO transcription factors:their roles in the maintenance of skeletal muscle homeostasis〔J〕.Cell Mol Life Sci,2014;71(9):1657-71.

3Puri S,Hebrok M.Diabetic β cells:to be or not to be〔J〕?Cell,2012;150(6):1103-4.

4Andrade JMO,Paraíso AF,Garcia ZM,etal.Cross talk between angiotensin-(1-7)/Mas axis and sirtuins in adipose tissue and metabolism of high-fat feed mice〔J〕.Peptides,2014;55(1):158-65.

5Rached MT,Kode A,Silva BC,etal.FoxO1 expression in osteoblasts regulates glucose homeostasis through regulation of osteocalcin in mice〔J〕.J Clin Inves,2010;120(1):357.

6Kousteni S.FoxO1, the transcriptional chief of staff of energy metabolism〔J〕.Bone,2012;50(2):437-43.

7Kim JJ,Li P,Huntley J,etal.FoxO1 haploin sufficiency protects against high-fat diet-induced insulin resistance with enhanced peroxisome proliferator-activated receptor γ activation in adipose tissue〔J〕.Diabetes,2009;58(6):1275-82.

8Gupta D,Leahy AA,Monga N,etal.Peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ ) and its target genes are downstream effectors of FoxO1 protein in islet β-cells mechanism of-cell compensation and failure〔J〕.J Biol Chem,2013;288(35):25440-9.

9Kamei Y,Mizukami J,Miura S,etal.A forkhead transcription factor FKHR up-regulates lipoprotein lipase expression in skeletal muscle〔J〕.FEBS Lett,2003;536(1):232-6.

10Tanaka H,Nagashima T,Shimaya A,etal.Effects of the novel Foxo1 inhibitor AS1708727 on plasma glucose and triglyceride levels in diabetic db/db mice〔J〕.Eur J Pharmacol,2010;645(1):185-91.

11Nagashima T,Shigematsu N,Maruki R,etal.Discovery of novel forkhead box O1 inhibitors for treating type 2 diabetes:improvement of fasting glycemia in diabetic db/db mice〔J〕.Mol Pharmacol,2010;78(5):961-70.

ExpressionandsignificanceofFoxO1andPPARγintheskeletalmuscleofKKAymice

LIAOXin,CHENQi-Rong,YANGYan,etal.

DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,Guizhou，China

ObjectiveTo observe the expression of FoxO1 and PPARγ in skeletal muscle of KKAy mice and explore the relationship between FoxO1 and glycolipid metabolism.MethodsKKAy mice with the high-fat diet were chosen into the diabetic model group (DM) (n=8),C57BL/6J mice were randomly divided into control group (NC) (n=8)and the high-fat diet group (HFD) (n=8).The blood samples were used for measuring fasting blood glucose (FBG), serum insulin (Ins), triglyceride (TG), total cholesterol(TC),high density lipoprotein-C(HDL-C) and low density lipoprotein-C (LDL-C).16 weeks later, insulin resistance was assessed by HOMA-IR. The FoxO1 and PPARγ mRNA expression levels in skeletal muscle were detected by real time quantitative(RT-PCR). The FoxO1 protein expression was detected by Western bolt method.ResultsLevels of FBG, TG, TC,LDL-C, Ins and HOMA-IR were significantly higher in DM group than those in control group and high-fat diet group. Levels of Ins, TC,LDL-C and HOMA-IR were significantly higher in the high-fat diet group than those in control group. The mRNA expression of PPARγ in skeletal muscle of DM group(0.56±0.05)was reduced when compared with control group(1.90±0.13)and the high-fat diet group(0.91±0.06)(P<0.01), the PPARγ mRNA expression in the high-fat group was lower than that of the control group(P<0.05). The mRNA level of FoxO1 in skeletal muscle of DM group(48.47±2.46)was higher than that of control group(18.26±2.49)and the high-fat diet group(20.00±2.06)(P<0.05). The protein expression of FoxO1 in skeletal muscle of DM group(4.73±.079) was higher than that of control group(0.91±0.17)and the high-fat diet group(1.26±0.16)(P<0.05). Moreover, the mRNA expression of FoxO1 in skeletal muscle was positively correlated with FBG(r=0.910,P<0.01), Ins(r=0.864,P<0.01), TG(r=0.897,P<0.01) and HOMA-IR(r=0.944,P<0.01); negatively correlated with PPARγ mRNA expression(r=-0.719,P<0.01).ConclusionsThe expression of FoxO1 is closely correlated with the glucose and lipid metabolism.

Forkhead box O1; Diabetes; Peroxisome proliferators-activated receptors

R587

A

1005-9202(2017)23-5759-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.006

国家自然科学基金(No.81660142);贵州省社会发展攻关项目〔SY(2013)3033〕

1 遵义医药高等专科学校护理系

高 琳(1962-)，女，教授，主要从事内分泌代谢性疾病基础及临床研究。

廖 鑫(1979-)，女，硕士，副主任医师，主要从事内分泌代谢性疾病基础及临床研究。

〔2016-12-19修回〕

(编辑 李相军/徐 杰)