兔关节软骨细胞的体外培养及凋亡相关基因在传代细胞中的表达

周叶 高越 王晓楠 朱立 厉蓓

兔关节软骨细胞的体外培养及凋亡相关基因在传代细胞中的表达

周叶 高越 王晓楠 朱立 厉蓓

目的验证体外Ⅱ型胶原酶消化法培养兔软骨细胞的可行性，探讨凋亡及抗凋亡基因在软骨细胞传代中的变化，寻找关节软骨退变老化研究的最适宜靶细胞。方法在无菌条件下取6周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨，采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法分离关节软骨细胞并进行原代、传代培养；形态学观察时采用甲苯胺蓝染色法对关节软骨细胞进行鉴定；RT-PCR法检测P0～P4代软骨细胞烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）、信息沉默因子1（Sirt1）、p53、Bax基因的mRNA相对表达量，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各代关节软骨细胞增殖情况。结果显微镜下观察兔原代软骨细胞大多呈透亮椭圆形、短梭形、多角形特征，72h全部贴壁生长。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞细胞质染成浅蓝色，细胞核染成深蓝色；前3代软骨细胞表型稳定，增殖力良好；连续培养至P4代后，绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状。随着软骨细胞的传代，NAMPT的表达量逐渐下调。与P0代软骨细胞相比，Sirt1的表达量在P1代细胞中明显上调，在P2代细胞急剧下降至P0代以下，在P3～P4代细胞中Sirt1的表达量逐渐下调。凋亡基因p53和Bax的表达量随着软骨细胞的传代而上调。前3代软骨细胞增殖差异无统计学意义（均P＞0.05）；在培养到第4～7天时，P1～P3代与P4代软骨细胞增殖差异有统计学意义（P＜0.05）。结论采用体外Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞是切实可行的。随着软骨细胞的传代，抗凋亡基因NAMPT、Sirt1的表达逐渐下调，凋亡基因p53、Bax的表达逐渐上调。P1～P3代关节软骨细胞作为研究关节软骨凋亡的细胞体系是合适的。

软骨细胞体外培养烟酰胺磷酸核糖转移酶信息沉默因子1传代

骨关节炎是一种常见的慢性关节疾病，其主要病变是骨关节软骨的退行性变和继发骨质增生。软骨细胞不仅可以合成、分泌基质，而且能控制细胞外基质的分布，是一种多功能细胞，其凋亡是骨关节炎关节软骨退变的关键因素。因此，骨关节炎发病机制相关研究应从软骨细胞本身入手。目前关于该病的发病机制、药物预防及治疗的研究多在动物模型中进行，因此从动物关节中成功获取关节软骨细胞并进行体外培养十分重要。本实验通过验证Ⅱ型胶原酶消化法培养兔软骨细胞的可行性，进一步研究软骨细胞传代中凋亡相关基因的变化，以探究其生物学特性，为从软骨细胞层面开展骨关节炎研究奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂6周龄新西兰大白兔1只，体重0.6kg，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。改良杜氏伊格尔（DMEM）完全培养基、FBS（美国GibcoBRL公司），四甲基偶氮唑盐（MTT）（美国Invitrogen公司），甲苯胺蓝、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司），RT-PCR试剂（日本TAKARA公司），cDNA第一链合成试剂盒、SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix(2X)（立陶宛MBI Fermentas公司），Trizol抽提试剂盒（美国Invitrogen公司），SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（日本TAKARA公司）。RT-PCR引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 原代软骨细胞提取及培养将新西兰白兔于耳缘静脉注射空气处死。在无菌操作下沿膝关节内侧切开关节囊，暴露关节面；用手术刀片取关节表面软骨，用含青霉素钠/庆大霉素双抗液的PBS冲洗数次；移入超净台，将软骨组织剪碎至1mm3的大小。加入0.25%胰蛋白酶5ml，磁力棒摇荡消化30min，轻轻吹打弃去上清液，PBS液清洗3次；加入2g/L的Ⅱ型胶原酶5ml并移入消化瓶中，将消化瓶放置恒温摇箱中，消化3～4h。待大部分细胞游离时，经200目不锈钢筛网过滤；15ml离心管收集细胞，低温离心1 000r/min，10min；弃上清液，加入体积分数10%FBS的DMEM培养基，用吸管轻轻吹打，使细胞悬液均匀分布。

1.2.2 软骨细胞的观察与鉴定取软骨细胞于倒置显微镜下观察生长情况及形态变化特点，并进行摄片记录。取对数生长期细胞进行细胞爬片，PBS清洗后多聚甲醛固定10min，甲苯胺蓝染色30min；最后在显微镜下观察软骨细胞形态。

1.2.3 软骨细胞传代培养软骨细胞置于5%CO2混和气体环境中，37℃恒温箱内单层培养，隔3d首次换液，传代培养期间，每2～3d根据细胞生长情况更换1次完全培养基，待镜下可观察到细胞增殖汇集成片，并铺满培养瓶底。占底面积70%～80%可进行传代培养，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞后，按1∶3的比例接种至75cm2培养瓶中，标记为P1代细胞。传代培养期间，每隔2～3d根据细胞生长情况更换1次DMEM完全培养基，待镜下观察细胞增殖汇集成片，并铺满培养瓶底占底面积70%～80%可再次进行传代培养，标记为P2代细胞。对P0、P1、P2、P3、P4代对数生长期细胞的增殖情况进行检测。

1.2.4 软骨细胞凋亡相关基因检测采用RT-PCR法。Trizol法提取P0～P4代软骨细胞RNA并获得cDNA，冰上混合脱氧核糖核酸嵌合荧光染料（DNA Master SYBR Green I Mix）10μl、上下游引物各0.4μl、双蒸水5.2μl及cDNA 4μl，轻轻混匀，离心5s后进行RT-PCR检测。反应条件：50°C预变性2min，95°C变性10min；95°C退火30s，60°C延伸30s，40个循环。反应完毕后分析产物溶解曲线判断反应的特异性并通过2-ΔΔCt得到目的基因的mRNA相对表达量。

1.2.5 各代细胞增殖情况检测采用MTT比色法。将传代细胞消化且作细胞计数后，调整细胞数量，并接种于96孔培养板中。空白调零孔加入0.1ml DMEM，其余各孔加入0.1ml体积分数10%FBS的DMEM；每孔接种细胞2×103个，每代接种一板，每板接种8列，共接种5板。各培养板置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中，隔天换液。分别于培养24、48、72、96、120、144、168h时取出进行检测，检测前4h每孔加入20μl MTT溶液，然后继续置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱中孵育。4h后用移液枪吸掉上清液，加入150μl DMSO，振摇10min，置酶标仪570nm波长测定吸光度值；待吸光度值≥1时，停止检测。

1.3 统计学处理应用GraphPad Prism 6.0统计软件。计量资料用示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 软骨细胞形态观察制备的兔原代软骨细胞体外培养状态下大多呈透亮椭圆形、短梭形、多角形，72h全部贴壁生长，见图1。

图1 原代兔膝关节软骨细胞形态（×200）

2.2 软骨细胞鉴定培养的P0～P4代软骨细胞均可被甲苯胺蓝染色，细胞呈蓝紫色，细胞核染色较深，细胞周围有少量蓝紫色异染颗粒出现。软骨细胞经传代培养后，生长速度明显加快，细胞排列紧密，染色加深，部分细胞形态变得细长，同时可见较多分裂细胞。连续培养至P4代后，细胞增殖速度略有减慢，细胞形态由大多呈细长形、三角形和多边形，逐渐转变为梭形、多边形或不规则形，见图2。

图2 P0～P4代兔膝关节软骨细胞鉴定（甲苯胺蓝染色，×200）

2.3 软骨细胞传代过程中凋亡相关基因表达的变化随着体外培养代数的增加，抗凋亡基因NAMPT表达逐渐下调，细胞传至P4代时，NAMPT的表达量仅为P0代软骨细胞的3.67%。与P0代软骨细胞相比，另一抗凋亡基因Sirt1的表达在P1代软骨细胞中明显上调；细胞传至P2代时，该基因的表达量又急剧下降至P0代以下，P3、P4代软骨细胞中的基因表达量则逐渐下调。与上述抗凋亡基因相反，凋亡基因p53和Bax的表达量则随着软骨细胞代数的增加而上调，见表1和图3。

2.4 软骨细胞传代过程中的增殖情况经MTT法检测，前3代软骨细胞增殖差异无统计学意义（均P＞0.05）；在培养第4～7天时，P1～P3代与P4代软骨细胞增殖差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图4（插页）。

表1 P0～P4代软骨细胞凋亡相关基因的mRNA相对表达量比较

3 讨论

图3 P0～P4代软骨细胞中相关基因表达变化（注：与P0比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

骨关节炎是一种慢性进行性关节疾病，主要表现为软骨退变、骨赘形成、软骨下骨重塑及关节内炎症反应[1]。孙鹏等[2]发现软骨细胞中内质网应激标志蛋白CRP78、CCAAT/CHOP表达升高，表明内质网应激所引发的软骨细胞凋亡可能是骨关节炎发展的原因之一。在实际临床工作中，患者关节软骨的获得还是相对困难的，因此我们借助动物细胞来建立实验细胞模型。本实验成功地采用体外Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞进行研究，证明该实验方法是切实可行的，且细胞较为纯化、增殖能力强、细胞表型不易改变。这与闫虎等[3]、刘振峰等[4]的实验研究一致。

在细胞的生命活动过程中，细胞增殖与凋亡都离不开信号的传导，即细胞增殖或凋亡的刺激信号通过细胞外、细胞膜、细胞质、细胞核，最后产生应答的途径传导。近年来的研究一致认为p38信号通路是关节软骨细胞凋亡的一条重要上游信号通路[5]。p38通过2条途径使p53蛋白表达增加，从而引起软骨细胞凋亡：一是磷酸化IKK（IκB的一个上游激酶），从而使NF-κB活化，进而增加p53的转录表达；二是直接磷酸化p53的丝氨酸15残基，稳定p53蛋白，使其含量增加。p53通过诱导促凋亡因子Bax的表达，从而引起细胞凋亡[6]。与促凋亡因子相反的是抗凋亡因子。Sirt1是Sir2在哺乳动物的同源基因，是一种依赖NAD＋的组蛋白去乙酰化，能与多种转录因子如p53、Ku70、PGC-1等相互作用，调节其转录活性，与细胞衰老、凋亡、代谢和增殖分化密切相关，Takayama等[7]研究证实Sirt1与人体软骨细胞凋亡相关。Liu等[8]发现SRT1720能够激活Sirt1，从而抑制软骨细胞凋亡。刘军等[9]发现薯蓣皂苷元能激活Sirt1通路，减轻骨关节炎病理过程中软骨细胞的线粒体氧化应激损伤，从而发挥抗骨关节炎中的软骨细胞保护作用。可见，Sirt1对软骨细胞的凋亡具有保护作用。NAMPT广泛表达于人体内脏脂肪组织、肌肉、骨骼、肝脏等器官和组织，并表达于神经细胞、成纤维细胞、心肌细胞、免疫细胞等多种细胞，可见该蛋白在生理及病理状态下均有重要作用[10]。有研究发现NAMPT通过调节Sirt1活性控制相应基因转录和众多代谢过程，具有抗凋亡作用[11]。根据以上文献报道，p53、Bax是凋亡基因，而Sirt1、NAMPT是抗凋亡基因。在本实验中，笔者成功地建立了体外兔关节软骨细胞体系，RT-PCR检测结果表明抗凋亡基因NAMPT及Sirt1的表达量随着软骨细胞代数的增加而下调，凋亡基因p53及Bax的表达量随着软骨细胞代数的增加而上调。从基因学角度证实以上结果，在细胞的传代过程中，抗凋亡基因和凋亡基因表达的变化是相反的。此外，显微镜下观察及MTT法也发现关节软骨细胞增殖速度随着传代逐渐减慢，细胞形态也变得不规则。结合显微镜下结果和软骨细胞的增殖曲线证实P1～P3代关节软骨细胞作为研究关节软骨凋亡的细胞体系是合适的，与相关文献报道一致[3]。但是本次实验最终采用的是兔关节软骨细胞，若能利用骨科髋关节及膝关节蜕变后期行关节置换术取到的人体细胞进行试验，结果将更有说服力。

笔者前期临床实验已证实，取自《千金方》的独活寄生汤和《医林改错》的身痛逐瘀汤的诸药加以化裁而成的“骨痹活络汤”能明显改善膝骨关节炎患者的临床症状，并且对其体内炎症因子NF-κB、基质金属蛋白酶-3

等具有明显下调作用[12]。上述方剂内含有多种中药及中药有效成分。本次实验检测结果仅为细胞生物学表现，后期可针对软骨细胞退变老化信号通路影响进行深入研究，并可在此研究的基础上进一步使用上述方剂中不同的中药或中药有效成分干预关节软骨细胞，研究不同药物对细胞凋亡及信号传导通路的影响，从分子学角度明确“骨痹活络汤”中的有效成分及作用，必将有更多的临床获益。

[1] Tamura T,Higuchi Y,Kitamura H,et al.Novel hyaluronic acidmethotrexate conjugate suppresses joint inflammation in the rat knee:efficacy and safety evaluation in two rat arthritis models[J].Arthritis Res Ther,2016,18:79.

[2] 孙鹏,李建,樊炜骏,等.独活寄生汤含药血清对膝骨性关节炎大鼠关节软骨细胞凋亡及GRP78、CHOP、HIRA及ASFla表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2017(13):158-163.

[3] 闫虎,苏友新,林学义,等.Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞[J].中国组织工程研究,2013(50):8647-8653.

[4] 刘振峰,方锐,孟庆才.Ⅱ型胶原酶消化法可短时间获得大量纯化大鼠关节软骨细胞[J].中国组织工程研究与临床康复,2011(50):9323-9326.

[5] Yu S M,Yeo H J,Choi S Y,et al.Cytokine-induced apoptosis inhibitor-1 causes dedifferentiation of rabbit articular chondrocytes via the ERK-1/2 and p38 kinase pathways[J].Int J Biochem Cell Biol,2016,80:10-18.

[6] Kim S J,Hwang S G,Shin D Y,et al.p38 kinase regulates nitric oxide-induced apoptosis of articular chondrocytes by accumulating p53 via NF-kappa B-dependent transcription and stabilization by serine 15 phosphorylation[J].J Biol Chem,2002,277(36):33501-33508.

[7] Takayama K,Ishida K,Matsushita T,et al.SIRT1 regulation of apoptosis of human chondrocytes[J].Arthritis Rheum,2009,60(9):2731-2740.

[8] Liu B,Lei M,Hu T,et al.Inhibitory effects of SRT1720 on the apoptosis of rabbit chondrocytes by activating SIRT1 via p53/Bax and NF-kappaB/PGC-1alpha pathways[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2016,36(3):350-355.

[9] 刘军,何晓乐,甄平,等.SIRT1信号通路介导薯蓣皂苷元在骨性关节炎软骨细胞代谢中的作用机制[J].中南大学学报(医学版),2017(2):121-127.

[10] Dahl T B,Holm S,Aukrust P,et al.Visfatin/NAMPT:a multifaceted molecule with diverse roles in physiology and pathophysiology[J].Annu Rev Nutr,2012,32:229-243.

[11] Revollo J R,Grimm A A,Imai S.The NAD biosynthesis pathway mediated by nicotinamide phosphoribosyltransferase regulates Sir2 activity in mammalian cells[J].J Biol Chem,2004,279(49):50754-50763.

[12] 周叶,洪鸣鸣,高越,等.骨痹活血汤对膝骨关节炎患者SphK1-S1P信号传导通路影响及疗效观察[J].中华中医药学刊,2015(11):2694-2696.

In vitro culture of rabbit articular chondrocytes and expression of apoptosis related genes in passage cells

ZHOU Ye,GAO Yue,WANG Xiaonan,et al.
Department of Comprehensive Health Care,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China

ObjectiveTo verify the feasibility of in vitro culture of rabbit chondrocytes with collagenaseⅡdigestion method and to investigate the changes of apoptosis and anti apoptotic genes in chondrocyte passages.MethodsThe knee joint cartilage was obtained under aseptic condition from 6 week-New Zealand white rabbits.The chondrocytes were isolated and digested with type collagenaseⅡand primary culture and subculture were carried out.The articular chondrocytes were identified by morphological observation with toluidine blue staining.RT-PCR method was used to detect the relative expression of NAMPT,Sirt1,P53 and Bax genes in chondrocytes of various generations,and the proliferation of chondrocytes in articular cartilage was detected by MTT method.ResultsUnder the microscope observation of rabbit articular chondrocytes were mostly in oval translucent,short spindle,polygonal appearance,and the adherent growth was almost completely in 72h.Toluidine blue staining showed light blue cytoplasm and deep blue nuclei in cultured chondrocytes.The first 3 generations of chondrocytes showed stable phenotype and good proliferation.In the fourth generation,most of the cells changed to long spindle and irregular-shaped.With the passage of chondrocytes,the expression of NAMPT decreased gradually.Compared with the P0 generation of cartilage cells,the expression of Sirt1 in P1 cells was significantly up-regulate,then decreased rapidly in P2 cells,and down-regulated in P3-P4 cells.The expression levels of apoptotic genes p53 and Bax were up-regulated with the passage of chondrocytes.MTT showed that there was no significant difference in the proliferation of chondrocytes among the first 3 generations(all P＞0.05).When cultured on day 4-7,the proliferation of chondrocytes was significantly different between P1-P3and P4 generations(P＜0.05).ConclusionIt is feasible to culture rabbit articular chondrocytes by collagenase digestion method in vitro.With the passage of chondrocytes,the expression of anti apoptotic genes NAMPT and Sirt1 decreased gradually,and the expression of apoptotic genes P53 and Bax increased gradually.P1-P3 joint chondrocytes are suitable for the study of chondrocyte apoptosis.

Chondrocyte Cultured in vitro NAMPT Sirt1Passage

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-2027

浙江省中医药科技计划项目（2014ZB079）

310006杭州市第一人民医院综合保健科

高越，E-mail：gy9821@sina.com

2017-08-24）

（本文编辑：陈丹）