叶酸对动脉粥样硬化的干预机制研究进展

潘孙雷 池菊芳 郭航远

叶酸对动脉粥样硬化的干预机制研究进展

潘孙雷 池菊芳 郭航远

动脉粥样硬化是一种常见的心血管疾病，是导致心肌梗死、心力衰竭、中风的主要原因。叶酸作为一种水溶性维生素，已有大量的临床和基础研究证实，服用叶酸能降低同型半胱氨酸浓度，改善血管内皮功能，抑制血管平滑肌增殖迁移，抑制脂质过氧化，减少泡沫细胞形成，从而发挥对心血管的保护作用，延缓动脉粥样硬化的发生、发展。本文就近年来叶酸对动脉粥样硬化的干预研究进展进行综述。

叶酸动脉粥样硬化同型半胱氨酸

叶酸是一种水溶性维生素，广泛存在于水果蔬菜中，参与DNA的甲基化和DNA、RNA以及蛋白质的合成，在细胞代谢、分化和增殖中扮演重要角色。高同型半胱氨酸血症已被证实是动脉粥样硬化的独立危险因素，而叶酸参与同型半胱氨酸代谢过程。研究发现补充叶酸可以降低循环血中同型半胱氨酸浓度，延缓动脉粥样硬化的发生、发展，在动脉粥样硬化的预防中发挥着重要的作用。本文将叶酸对动脉粥样硬化的干预机制研究进展作一综述。

1 叶酸与同型半胱氨酸及动脉粥样硬化概述

动脉粥样硬化是多种心脑血管疾病的病理基础。基本病变是血管内膜脂质沉积，大量的炎症细胞浸润，粥样斑块形成，血管壁变硬增厚，管腔狭窄闭塞，导致相应动脉缺血缺氧，最终发生心脑血管疾病。

同型半胱氨酸的血浆正常浓度为5～15mol/L。影响同型半胱氨酸代谢的因素有年龄、性别、叶酸水平、生活习惯、遗传因素、药物和某些疾病。高同型半胱氨酸导致动脉粥样硬化的机制目前仍未清楚，主要可能与损伤血管内皮细胞，抑制内皮细胞增殖，NO合成减少，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），刺激平滑肌细胞的增殖迁移，诱导巨噬细胞转变为泡沫细胞，激活炎症细胞，激活血小板的黏附聚集等有关[1]。

叶酸作为一种B族维生素，在人体中以5-甲基四氢叶酸的形式存在，四氢叶酸为作为一碳单位的转移酶，是核苷酸的合成和甲基化反应的一个重要调节因子。人体内由于无法合成叶酸，因此需要依靠饮食摄入保证叶酸的正常含量。研究表明低膳食叶酸能增加血管疾病包括动脉粥样硬化和中风的发病风险，而高循环叶酸浓度能减少依赖同型半胱氨酸的原发性冠状动脉事件和颈动脉内膜增厚的发生风险。另外，补充叶酸对心血管疾病患者或者高危人群的血管功能具有积极的影响[2]。叶酸可以通过降低同型半胱氨酸浓度，改善血管内皮功能，抑制血管平滑肌增殖迁移，抑制脂质过氧化，减少泡沫细胞形成，从而发挥对心血管保护作用，延缓动脉粥样硬化的发生、发展。

2 叶酸修复血管内皮功能

血管内膜是血液与血管壁的第一层屏障，正常的内皮细胞具有细胞通透性、选择性屏障、止血抗凝、抗炎和血管活性物质代谢等作用。内膜的完整性在维持血管舒张活性，减少血栓形成，抑制炎症细胞浸润等方面发挥重要作用。内膜损伤往往是动脉粥样硬化发生的起始因素，动脉粥样硬化的各个阶段都伴有血管内皮功能障碍。内皮细胞结构和功能改变导致血管屏障功能受损，血管收缩异常，张力增加，使血液中的单核细胞和脂质等成分易于在内皮下间隙沉积，从而形成泡沫细胞[3]。Cheng等[4]证实叶酸显著提高内皮细胞存活率，与缺氧组内皮细胞相比降低内皮细胞的凋亡。叶酸同样降低活性氧水平，增加内皮细胞亚硝酸盐的含量。另外证实缺氧降低细胞生存率并通过ERK1/2/NOX4/ROS通路诱导内皮凋亡，而叶酸抑制这一通路从而保护缺氧所致内皮细胞损伤。

2.1 叶酸通过降低同型半胱氨酸浓度改善血管内皮功能Chambers等[5]报道对冠心病患者分别用叶酸（5mg）和维生素B12（1mg）8周后，其血管舒张功能改善[（2.5±3.2）%vs（4.0±3.7）%，P=0.002]，而对照组服用安慰剂8周后未见改善[（2.3±2.6）%vs（1.9±2.6）%，P=0.5]。叶酸和维生素B12治疗8周后，血浆总同型半胱氨酸浓度[（13.0±3.4）mol/L vs（9.3±1.9）mol/L，P＜0.001]，蛋白结合同型半胱氨酸浓度[（8.7±2.8）mol/L vs（6.2±1.4）mol/L，P＜0.001]，游离同型半胱氨酸浓度[（4.3±1.2）mol/L vs（3.0±0.6）mol/L，P＜0.001]均降低，而叶酸浓度[（10.3±4.3）mol/L vs（31.2±10.8）mol/L，P＜0.001]升高，回归分析显示血管舒张功能与游离同型半胱氨酸呈负相关（r=-0.26，P=0.001）。结果显示补充叶酸和维生素B12能改善冠心病患者的内皮功能，可能是通过降低游离同型半胱氨酸浓度从而增加NO利用度，改善血管内皮功能。结果提示补充叶酸能降低已确定动脉粥样硬化人群的心血管事件发生风险。Guo等[6]报道对有高同型半胱氨酸血症的高风险的冠心病患者补充叶酸6个月，同型半胱氨酸浓度显著降低[（18.3±3.9）mol/L vs（11.5±2.8）mol/L，P＜0.01]，血管舒张功能显著提高（6.8%±2.1%vs 8.9%±1.7%，P＜0.01），提示对于高同型半胱氨酸血症的高风险的冠心病患者，叶酸可以降低血同型半胱氨酸浓度从而改善内皮功能。

2.2 叶酸通过抗氧化机制保护血管内皮细胞缺氧能导致内皮细胞的炎症和氧化应激，从而导致内皮细胞损伤和NO产生，对抗氧化应激有助于预防心血管疾病[7]。Salama等[8]报道叶酸能改善甲状腺功能减退小鼠的氧化应激水平和肾脏组织结构。Mohammadian等[9]报道肝脏是叶酸贮存和代谢的主要场所，叶酸缺乏严重影响细胞代谢，增加氧化应激和血同型半胱氨酸水平。补充叶酸能降低同型半胱氨酸，并通过抗氧化作用改善由胆汁淤积造成的肝脏生化功能。Ebaid等[10]报道在动物实验中，叶酸能改善大鼠的氧化应激水平。这些结果提示补充叶酸可以抑制氧化应激，改善血管内皮功能，延缓动脉粥样硬化。

2.3 叶酸通过减少一氧化氮合酶（eNOS）失偶联作用改善血管内皮功能Moat等[11]报道予84例冠心病患者分别服用叶酸400g/d和5mg/d，持续6周后，发现患者血清叶酸含量均显著提高，同型半胱氨酸浓度降低。5mg/d的叶酸改善血管舒张功能，而补充400g/d叶酸未见明显改善。在体外的叶酸实验中，发现叶酸能逆转由同型半胱氨酸导致的内皮功能障碍，猜测可能是通过提高eNOS二聚体的含量改善内皮功能。Chalupsky等[12]报道叶酸能促进四氢生物蝶呤（BH4）的循环利用，增加eNOS，从而改善缺氧导致的肺动脉高压的内皮细胞。Taylor等[13]报道叶酸通过增加cGMP浓度，激活PI3K/Akt信号通路，导致eNOS磷酸化，这部分解释了补充叶酸有利于改善血管功能。

有研究表明，5-甲基四氢叶酸（5-MTHF）是循环叶酸参与同型半胱氨酸代谢的产物，通过清除过氧亚硝基阴离子自由基，增强NO的生物利用度，降低血管超氧化物歧化酶生成，对血管内皮功能有直接影响[14]。补充叶酸能增加体内5-MTHF的含量，从而增加NO的合成，发挥对血管内皮的保护作用。eNOS的偶联对维持血管氧化还原平衡起着关键作用。BH4具有稳定eNOS结构的作用，是eNOS发挥功能的辅助因子。BH4也能促进eNOS的二聚化和NO的合成。BH4水平下降，eNOS二聚体发生解偶联[15]。Moens等[16]认为叶酸可能通过以下途径增加内皮细胞的NO含量：（1）5-MTHF直接改善eNOS的活性；（2）叶酸加强BH4和eNOS的亲和力，增加BH4的生物利用度；（3）叶酸能稳定BH4的结构；（4）叶酸通过将BH2还原为BH4使体内BH4含量增加。

3 叶酸抑制血管平滑肌增殖迁移

血管平滑肌细胞分化是血管发育的一个重要组成部分。血管平滑肌细胞主要功能是调节血管直径、血压以及血流分布。血管平滑肌细胞和心肌骨骼肌等终末分化细胞不同，在成熟的动物体内仍保持显著的可塑性，在受到外界环境刺激后能进行可逆的表型变化[17]。在正常情况下，平滑肌细胞保持静止和非迁移状态，在各种生长因子和细胞因子的刺激下，平滑肌细胞去分化，其增殖和迁移能力增强。血管平滑肌细胞作为血管壁重要的细胞类型，参与动脉粥样硬化形成的各个阶段[18]。动脉粥样硬化过程中，平滑肌从中膜迁移至内膜经历3个阶段：平滑肌细胞从收缩表型到合成表型，细胞外基质（ECM）蛋白的降解，从降解的基质中穿透至内膜[19]。

Duthie等[2]通过对ApoE基因敲除小鼠不同饲料喂养16周后研究发现，与正常普通饲料组相比，高脂饲料组小鼠动脉粥样斑块体积增加接近2倍（P＜0.0001）。与高脂饲料组相比，高脂饲料但缺乏叶酸组小鼠动脉粥样斑块体积显著增加（17%，P＜0.05）。研究结果显示与高脂饲料组相比，高脂饲料但缺乏叶酸喂养ApoE基因敲除小鼠主动脉蛋白表达显著改变（P＜0.05），并与主动脉外膜脂蛋白浓度显著相关（P＜0.001）。与高脂饮食组相比，叶酸缺乏加重诸如氧化应激、炎症和平滑肌细胞的迁移等过程。结果提示叶酸缺乏可能加速动脉粥样硬化的进展。

Guo等[20]报道同型半胱氨酸能显著增加基质金属蛋白酶2（MMP-2）的产生，平滑肌细胞的增殖迁移导致动脉粥样硬化斑块需要细胞外基质金属蛋白酶（MMPs）重构细胞外基质，而叶酸能降低由同型半胱氨酸诱导增加的MMP-2，结果提示叶酸抑制细胞外基质蛋白的降解从而延缓动脉粥样硬化的发展。Han等[21]报道平滑肌细胞增殖，PDGF mRNA和蛋白表达以及PDGF启动子脱甲基化与同型半胱氨酸浓度呈剂量相关性。平滑肌细胞G0/G1期减少以及S期增多提示同型半胱氨酸诱导平滑肌细胞增殖。另外，S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH）水平增加和S-腺苷蛋氨酸（SAM）水平降低部分解释了同型半胱氨酸干预使PDGF低甲基化。猜测同型半胱氨酸导致PDGF启动子低甲基化，并上调PDGF mRNA和蛋白的表达，最终导致平滑肌细胞的增殖。而补充叶酸能拮抗同型半胱氨酸诱导的平滑肌增殖、异常PDGF脱甲基化和PDGF表达[21]。这些结果反映叶酸能通过抑制平滑肌的增殖迁移来延缓动脉粥样硬化的进展。

4 叶酸抑制脂质过氧化，减少巨噬细胞形成泡沫细胞

动脉粥样硬化的斑块稳定性与病灶内脂质大小、巨噬细胞数量以及炎症反应等方面有关，作为炎症因子的主要来源巨噬细胞在动脉粥样硬化的进展中起到了重要作用。近年来有研究表明，巨噬细胞在动脉粥样斑块中存在两种类型，促炎型（M1）和抗炎型（M2），两者的失平衡影响斑块的稳定性[22]。研究显示动脉粥样硬化形成的早期，在血管内皮细胞、平滑肌细胞和单核细胞产生巨噬细胞集落刺激因子的作用下，单核细胞迁入内皮下间隙并聚集，巨噬细胞产生蛋白酶、脂酸、自由基、活性氧和其他细胞毒素，将LDL氧化成ox-LDL，依赖清道夫受体摄取ox-LDL，形成动脉粥样硬化特征性细胞泡沫细胞[23]。Joshi等[24]报道叶酸作为一种自由基的清除剂，可以抑制脂质过氧化。Ebaid等[10]报道叶酸能降低TC、TG和LDL的血清浓度，减少巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞。另外，同型半胱氨酸能使巨噬细胞中的诱导型一氧化氮合酶（i-NOS）异常高表达，产生大量NO，并能激活核因子-κB（NF-κB），加重动脉粥样硬化的损伤[25]。叶酸通过与eNOS相互作用直接产生抗氧化作用，并影响辅助因子NO的生物利用度，降低动脉粥样硬化的损伤。

综上所述，高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化的独立危险因素已成为学术界共识，但是其致动脉粥样硬化具体机制仍有待进一步阐明，叶酸通过降低循环血同型半胱氨酸浓度和其他机制影响动脉粥样硬化的发展，具有预防和延缓动脉粥样硬化，降低心血管事件的发生，如图1所示。但是叶酸在预防动脉粥样硬化时，所需剂量及服用时间仍然有待于大规模的临床前瞻性研究。

图1 叶酸对动脉粥样硬化的干预机制

[1] Mccully K S.Homocysteine and the pathogenesis of atherosclerosis[J].Expert review of clinical pharmacology,2015,8(2):211-219.doi:10.1586/17512433.2015.1010516.

[2] Duthie S J,Beattie J H,Gordon M J,et al.Nutritional B vitamin deficiency alters the expression of key proteins associated with vascular smooth muscle cell proliferation and migration in the aorta of atherosclerotic apolipoprotein E null mice[J].Genes&nutrition,2015,10(1):446.doi:10.1007/s12263-014-0446-y.

[3] Sitia S,Tomasoni L,Atzeni F,et al.From endothelial dysfunction to atherosclerosis[J].Autoimmunity reviews,2010,9(12):830-834.doi:10.1016/j.autrev.2010.07.016.

[4] Cheng F,Lan J,Xia W,et al.Folic Acid Attenuates Vascular EndothelialCellInjury Caused by Hypoxia via the Inhibition of ERK1/2/NOX4/ROS Pathway[J].Cellbiochemistry and biophysics,2016,74(2):205-211.doi:10.1007/s12013-016-0723-z.

[5] Chambers J C,Ueland P M,Obeid O A,et al.Improved vascular endothelial function after oral B vitamins:An effect mediated through reduced concentrations of free plasma homocysteine[J].Circulation,2000,102(20):2479-2483.

[6] Guo H,Lee J D,Xing Y,et al.Changes of homocysteine levels and arterial endothelial function in patients with high risk of coronary artery disease after 6-month folic acid supplementation[J].Acta cardiologica,2004,59(5):503-506.doi:10.2143/ac.59.5.200 5223.

[7]Zhang P Y,Xu X,Li X C.Cardiovascular diseases:oxidative damage and antioxidant protection[J].European review for medical and pharmacological sciences,2014,18(20):3091-3096.

[8] Salama A F,Tousson E,Ibrahim W,et al.Biochemical and histopathological studies of the PTU-induced hypothyroid rat kidney with reference to the ameliorating role of folic acid[J].Toxicology and industrial health,2013,29(7):600-608.doi:10.1177/0748233711432577.

[9] Mohammadian Z,Eidi A,Mortazavi P,et al.Effects of folic acid on dyslipidemia and serum homocysteine in a rat model of cholestasis and hepatic fibrosis[J].Polish journal of pathology:official journal of the Polish Society of Pathologists,2015,66(1):49-56.

[10] Ebaid H,Bashandy S A,Alhazza I M,et al.Folic acid and melatonin ameliorate carbon tetrachloride-induced hepatic injury,oxidative stress and inflammation in rats[J].Nutrition&metabolism,2013,10(1):20.doi:10.1186/1743-7075-10-20.

[11] Moat S J,Madhavan A,Taylor S Y,et al.High-but not low-dose folic acid improves endothelial function in coronary artery disease[J].European journal of clinical investigation,2006,36(12):850-859.doi:10.1111/j.1365-2362.2006.01739.x.

[12] Chalupsky K,Kracun D,Kanchev I,et al.Folic acid promotes recycling of tetrahydrobiopterin and protects against hypoxia-Induced pulmonary hypertension by recoupling endothelial nitric oxide synthase[J].Antioxid Redox Signal,2015,23(14):1076-1091.doi:10.1089/ars.2015.6329.

[13] Taylor S Y,Dixon H M,Yoganayagam S,et al.Folic acid modulates eNOS activity via effects on posttranslational modifications and protein-protein interactions[J].European journal of pharmacology,2013,714(1-3):193-201.doi:10.1016/j.ejphar.2013.05.026.

[14] Antoniades C,Shirodaria C,Leeson P,et al.MTHFR 677 C＞T Polymorphism reveals functional importance for 5-methyltetrahydrofolate,not homocysteine,in regulation of vascular redox state and endothelial function in human atherosclerosis[J].Circulation,2009,119(18):2507-2515.doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.108.808675.

[15] Chalupsky K,Cai H.Endothelial dihydrofolate reductase:critical for nitric oxide bioavailability and role in angiotensin II uncoupling of endothelial nitric oxide synthase[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(25):9056-9061.doi:10.1073/pnas.0409594102.

[16] Moens A L,Vrints C J,Claeys M J,et al.Mechanisms and potential therapeutic targets for folic acid in cardiovascular disease[J].American journal of physiology Heart and circulatory physiology,2008,294(5):H1971-1977.doi:10.1152/ajpheart.91503.2007.

[17] Bennett M R,Sinha S,Owens G K.Vascular Smooth Muscle Cells in Atherosclerosis[J].Circulation research,2016,118(4):692-702.doi:10.1161/CIRCRESAHA.115.306361.

[18] Doran A C,Meller N,Mcnamara C A.Role of smooth muscle cells in the initiation and early progression of atherosclerosis[J].Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology,2008,28(5):812-819.doi:10.1161/ATVBAHA.107.159327.

[19] Rzucidlo E M,Martin K A,Powell R J.Regulation of vascular smooth muscle cell differentiation[J].Journal of vascular surgery,2007,45(SupplA):25-32.doi:10.1016/j.jvs.2007.03.001.

[20] Guo H,Lee J D,Uzui H,et al.Effects of folic acid and magnesium on the production of homocysteine-induced extracellular matrix metalloproteinase-2 in cultured rat vascular smooth muscle cells[J].Circulation journal:officialjournalofthe Japanese Circulation Society,2006,70(1):141-146.

[21] Han X B,Zhang H P,Cao C J,et al.Aberrant DNA methylation of the PDGF gene in homocysteinemediated VSMC proliferation and its underlying mechanism[J].Mol Med Rep,2014,10(2):947-954.doi:10.3892/mmr.2014.2249.

[22] Moore K J,Sheedy F J,Fisher E A.Macrophages in atherosclerosis:a dynamic balance[J].Nature reviews Immunology,2013,13(10):709-721.doi:10.1038/nri3520

[23] Robbins C S,Hilgendorf I,Weber G F,et al.Local proliferation dominates lesional macrophage accumulation in atherosclerosis[J].Nature medicine,2013,19(9):1166-1172.doi:10.1038/nm.3258.

[24] Joshi R,Adhikari S,Patro B S,et al.Free radical scavenging behavior of folic acid:evidence for possible antioxidant activity[J].Free radical biology&medicine,2001,30(12):1390-1399.

[25] Wang Y,Wang G Z,Rabinovitch P S,et al.Macrophage mitochondrial oxidative stress promotes atherosclerosis and nuclear factor-kappaB-mediated inflammation in macrophages[J].Circulation research,2014,114(3):421-433.doi:10.1161/circresaha.114.302153.

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2016-1776

浙江省科技厅公益项目（2016C33227）

325000温州医科大学第一临床医学院（潘孙雷）；绍兴市人民医院心内科（池菊芳、郭航远）

郭航远，E-mail：ghangyuan@hotmail.com

2016-11-01）

（本文编辑：马雯娜）