磷酸化4E-BP1在结直肠癌中的表达及与临床病理特征、预后的关系

陈亦明 王继生 徐鲁白 周斌 范恒伟 高静 谢君青

磷酸化4E-BP1在结直肠癌中的表达及与临床病理特征、预后的关系

陈亦明 王继生 徐鲁白 周斌 范恒伟 高静 谢君青

目的探讨磷酸化的真核翻译起始因子结合蛋白（p-4E-BP1）在结直肠癌组织中的表达及与临床病理特征、预后的关系。方法采用免疫组化染色检测164例患者结直肠癌组织中p-4E-BP1表达，采用qRT-PCR、Western bolt法检测结直肠癌组织及其癌旁正常组织中4E-BP1、p-4E-BP1的mRNA、蛋白表达，应用Kaplan-Meier法和Cox比例风险回归模型对结直肠癌患者进行生存分析。结果164例结直肠癌患者中p-4E-BP1均有表达，其中低表达69例（42.1%），高表达95例（57.9%）。p-4E-BP1表达与结直肠癌患者的肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期均有关，其中细胞分化较差、浸润较深、淋巴结转移、TNM分期较晚的结直肠癌患者p-4E-BP1表达均较高（均P＜0.05）。结直肠癌组织中4E-BP1 mRNA、蛋白表达与癌旁正常组织比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；而p-4E-BP1蛋白表达较癌旁正常组织明显增高（P＜0.05）。p-4E-BP1高表达组无进展生存期、总生存期均明显短于低表达组（均P＜0.05）。p-4E-BP1蛋白表达是影响患者术后总生存期、无进展生存期的独立风险因素（RR=5.414、4.754，均P＜0.05）。结论p-4E-BP1高表达与肿瘤进展以及不良预后相关，p-4E-BP1可作为临床判断结直肠癌患者预后的一个新指标。

结肠直肠癌4E-BP1磷酸化临床病理特征预后

真核翻译起始因子4E-结合蛋白（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein，4E-BP1）由118个氨基酸组成，编码基因定位于染色体8p12，对真核翻译起始因子4E（eIF4E）活性的调节起着重要作用。4E-BP1是PI3K/AKT/mTOR和RAS/MAPK信号通路最具代表性的底物。4E-BP1被哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化活化后，参与RNA翻译和细胞生长的调控[1-3]。近年来研究发现，磷酸化4E-BP1（p-4E-BP1）的高表达与食管鳞状细胞癌、肝门胆管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌和肾癌等恶性程度及预后密切相关[4-8]，提示p-4E-BP1发挥致癌作用。本研究拟通过检测p-4E-BP1在结直肠癌中的表达，以探讨其与结直肠癌临床病理特征及预后的关系。

1 对象和方法

1.1 对象选择2007年3月至2009年10月在本院行根治性或姑息性切除的结直肠癌患者164例为研究对象，其中男75例，女89例；年龄21～91（65.3±14.6）岁。所有患者术前均未接受放、化疗等抗肿瘤治疗，并具有完整的临床资料记录和随访记录。收集手术切除的结直肠癌组织标本及距离肿瘤5cm的正常结直肠组织标本，冻存于-80℃冰箱备用。

1.2 主要试剂p-4E-BP1（Thr37/46）单克隆抗体和4EBP1单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；En vision免疫组化检测试剂盒购自丹麦Dako公司；Trizol试剂盒和M-MLV逆转录酶均购自美国Invitrogen公司；实时PCR试剂盒购自美国Bio-Rad公司；BCA试剂盒购自美国Thermo公司。所用引物由上海铂尚生物科技有限公司根据设计合成（4E-BP1上游引物为5′-GGGGACTACAGCACGAC-3′，下游引物为5′-CGCCCG CTTATCTTCT-3′；内参照基因GAPDH上游引物为5′-GGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′，下游引物为5′-CCTGGAAGATGGTGA TGGG-3′）。

1.3 免疫组化染色及判定标准将手术中切除的结直肠癌组织标本用10%甲醛固定，常规脱水并石蜡包埋，制成4μm组织切片。将切片置于温热的二甲苯溶液中充分脱蜡，然后置于梯度乙醇中浸泡水化，3%过氧化氢中封闭10min。用pH6.0的柠檬酸盐缓冲液在95～100℃下抗原修复10min；用3%BSA封闭后，滴加兔抗p-4EBP1（Thr37/46）单克隆抗体（1∶300）4°C孵育过夜。PBS冲洗3次，滴加聚合物增强剂并室温孵育20min；漂洗后加入酶标二抗，37°C水浴箱孵育30min；DAB试剂显影5min，苏木精复染。PBS代替一抗作为阴性对照。用双盲法对染色结果进行评估。p-4E-BP1蛋白主要定位于细胞核和细胞质，阳性细胞呈淡黄、棕黄、黄褐色。每张切片随机选择5个视野，每个视野计数100个细胞，得出阳性细胞百分比并赋分值：＜10%为0分，10%～为1分，33%～为2分，≥66%为3分；免疫染色强度赋分标准：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；2项评分的乘积为该例标本的最终染色评分值，按分值高低分级，即≤6分为低表达，＞6分为高表达。1.4qRT-PCR法检测mRNA表达根据TRIZOL试剂说明书裂解结直肠癌及癌旁正常组织，以分离总RNA；使用M-MLV逆转录酶，以总RNA为模版逆转录成cDNA。PCR扩增条件：95°C预变性3min，94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸1min；30个循环后，72°C延伸5min。以GAPDH为内参，根据2-ΔΔCt方法计算目的基因相对表达水平。

1.5 Western blot法检测蛋白表达提取结直肠癌及癌旁正常组织的总蛋白，使用BCA试剂盒检测细胞中总蛋白浓度。各组上样30μg总蛋白，用10%SDSPAGE分离蛋白质后转至硝酸纤维素膜，置于5%脱脂牛奶中室温封闭2h，一抗4E-BP1（1∶1 000）和p-4EBP1（1∶1 000）4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，10min/次；将膜浸泡到相应的二抗中，室温孵育2h；再次洗涤，化学发光显影。用Image J图像分析软件对目的条带灰度值进行定量分析，以β-Actin为内参计算4E-BP1表达水平，以4E-BP1为内参计算p-4E-BP1表达水平；通过计算与相应内参灰度值的比值，得到相对表达水平。1.6统计学处理应用SPSS 18.0统计软件。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。计量资料呈正态分布表示，组间比较采用方差分析；若呈偏态分布用M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析；总生存期是指手术日至病死或最后随访日期的时间，无进展生存期是指手术日至疾病进展或最后一次随访的时间。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果免疫组化染色结果显示，p-4E-BP1在结直肠癌组织中均有表达，在细胞核、细胞质染成棕黄色或棕褐色，呈弥漫性分布。其中低表达69例（42.1%），高表达95例（57.9%），见图1。

图1 免疫组化染色检测结直肠癌组织中p-4E-BP1的表达（a：p-4E-BP1在癌组织中低表达；b：p-4E-BP1在癌组织中高表达；En vision法，×200）

2.2 p-4E-BP1表达与临床病理特征的关系p-4EBP1表达与结直肠癌患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径和血行转移均无关（均P＞0.05）；但与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期均有关（均P＜0.05），其中细胞分化较差、浸润较深、淋巴结转移、TNM分期较晚的结直肠癌患者p-4E-BP1表达较高，见表1。

表1 164例结直肠癌患者p-4E-BP1表达与临床病理特征的关系[例（%）]

2.3 p-4E-BP1在结直肠癌组织及其癌旁正常组织的表达比较qRT-PCR检测发现结直肠癌组织中4EBP1 mRNA表达与癌旁正常组织比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。Western blot结果显示结直肠癌组织中4E-BP1蛋白表达与癌旁正常组织比较，差异亦无统计学意义（P＞0.05）；而结直肠癌组织中p-4EBP1蛋白表达较癌旁正常组织明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3-4。

图2 164例结直肠癌组织及其癌旁正常组织中4E-BP1 mRNA表达的比较

图3 Western blot检测结直肠癌组织及其癌旁正常组织中4E-BP1、p-4E-BP1蛋白表达的电泳图（T：结直肠癌组织；N：癌旁正常组织；α-Actin：内参对照）

2.4 p-4E-BP1蛋白表达与结直肠癌术后生存期的关系p-4E-BP1高表达组中位无进展生存期为25（17.4，27.2）个月，明显短于低表达组的38（29.3，44.7）个月，差异有统计学意义（P＜0.05）；p-4E-BP1高表达组总生存期为67（52.7，73.2）个月，亦明显短于低表达组的82（68.5，91.3）个月，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组患者结直肠癌术后Kaplan-Meier生存曲线见图5。

图4 164例结直肠癌组织及其癌旁正常组织中4E-BP1、p-4E-BP1蛋白表达的比较（a：4E-BP1相对α-Actin的表达；b：p-4E-BP1相对4E-BP1的表达）

2.5 影响结直肠癌患者生存因素的Cox比例风险回归分析将患者性别、年龄、肿瘤位置、分化程度、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移、血行转移、TNM分期、p-4EBP1蛋白表达等10项临床病理特征纳入Cox比例风险回归模型进行分析，结果显示肿瘤直径、淋巴结转移、血行转移、TNM分期与总生存期均存在相关性（均P＜0.05），分化程度、浸润深度、淋巴结转移、血行转移、TNM分期与无进展生存期均有相关性（均P＜0.05）。同时发现p-4E-BP1蛋白表达是影响患者术后总生存期、无进展生存期的独立风险因素（RR=5.414、4.754，均P＜0.05），见表2。

图5 不同p-4E-BP1蛋白表达的结直肠癌患者Kaplan-Meier生存曲线（a：无进展生存；b：总生存）

表2 影响结直肠癌患者生存因素的Cox比例风险回归分析

3 讨论

近年来，结直肠癌发病率及病死率逐年上升，结直肠癌患者也呈现年轻化趋势，且术后复发率高、复发后易导致预后不良。因此，寻找一种新的预后标志物对预防结直肠癌的复发、转移并改善患者预后具有重要意义。近年来研究表明，多个分子标志物与常规临床病理因素结合，能更准确地预测结直肠癌患者的预后[9-11]。生长因子受体和细胞信号通路在肿瘤发生、发展中起着关键作用。膜生长因子受体被激活后通过PI3K/AKT/mTOR和RAS/MAPK信号通路将信号转导入细胞内，促进细胞增殖。与细胞增殖、存活、凋亡和代谢相关的MAPK信号通路，参与介导4E-BP1的磷酸化。PI3K/AKT经典的信号通路也经mTOR磷酸化激活下游分子4E-BP1，进而启动mRNA的翻译[1-3]。在帽依赖性翻译期间，eIF4E结合mRNA帽子结构并促进eIF4E起始复合物的形成。非磷酸化的4E-BP1竞争性地结合到eIF4E，并阻碍帽依赖性mRNA翻译起始复合物的形成，从而抑制蛋白质的翻译起始。当4E-BP1接受上游信号被磷酸化激活后，4E-BP1与eIF4E解离，促使eIF4E起始复合物的形成，从而启动帽依赖性翻译，促进蛋白质的合成[12]。eIF4E能调控翻译，是肿瘤发生中起重要作用的关键蛋白，如Myc、细胞周期蛋白D1、血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子[13]，4E-BP1抑制eIF4E调节的蛋白质翻译；反之，4E-BP1磷酸化使这种抑制作用解除。因此，4E-BP1的磷酸化具有致癌潜力。研究发现p-4E-BP1和eIF4E协同促进肾癌的进展[8]。Avdulov等[14]研究表明eIF4E是乳腺癌恶性表型的重要标志，4EBP1磷酸化对乳腺细胞的恶性转化起着重要作用。此外，4E-BP1磷酸化位点的突变可以抑制乳腺细胞的恶化；但这些4E-BP1磷酸化位点突变恢复后，又重现了它们的恶性表型。上述证据提示4E-BP1磷酸化可能通过释放eIF4E并增强帽依赖性翻译，促进肿瘤细胞生长和增殖。

本研究结果发现，结直肠癌组织中p-4E-BP1表达水平升高。相关研究报道在食管鳞状细胞癌、肝门胆管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌和肾癌等恶性肿瘤组织中p-4E-BP1表达亦明显升高[4-8]，与本研究结果一致。本研究对164例结直肠癌患者分析发现，p-4E-BP1的表达水平与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期均明显相关；组织细胞分化差、浸润深、淋巴结转移或TNM分期较晚的结直肠癌组织中p-4E-BP1表达水平较高。对6例结直肠癌患者进一步分析发现，结直肠癌组织中4E-BP1的mRNA、蛋白表达水平与癌旁正常组织比较差异均无统计学意义，而p-4E-BP1蛋白水平明显增加。根据以上结果，笔者推测4E-BP1磷酸化促进了结直肠癌的发生、发展，具有潜在的促癌功能。但由于本研究RT-PCR和Western blot的样本量较少，且组织标本可能存在异质性，故该结论尚需大样本研究进一步证实。此外，本研究通过生存分析发现，p-4E-BP1蛋白表达水平与总生存期、无进展生存期密切相关，说明p-4E-BP1蛋白高表达可提示结直肠癌患者预后不良。

综上所述，p-4E-BP1在结直肠癌中表达增加，且p-4E-BP1高表达与结直肠癌的恶性生物学行为以及不良预后相关。因此，p-4E-BP1可作为结直肠癌预测预后的肿瘤标志物，抑制4E-BP1磷酸化可能成为结直肠癌治疗的新靶点。

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Expression of phosphorylated 4E-BP1 and its relationship to prognosis in colorectal cancer

CHEN Yiming,WANG Jisheng,XU Lubai,et al.
Department of Hepatobiliary Surgery,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

ObjectiveTo evaluate the expression of phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein(p-4E-BP1)and to assess its relationship with clinicopathological features and prognosis in patients with colorectal cancer.Methods The expression of p-4E-BP1in164specimens of colorectal cancer tissuewasdetected with immunohistochemistry.The expression of 4E-BP1 mRNA and protein in colorectal cancer and adjacent normal tissues were detected with qRT-PCR and Western bolt,respectively.Kaplan-Meier method and Cox proportional hazards regression model were used to analyze the survival of patients with colorectal cancer.Resultsp-4E-BP1 was positive in all colorectal cancer samples,including 95(57.9%)cases with high expression and 69(42.1%)cases with low expression.The expression level of p-4E-BP1 was significantly associated with tumor differentiation,invasive depth,lymph node metastasis and TNM stage.High expression of p-4E-BP1 was observed in colorectal cancer patients with poor differentiation,deeper infiltration,regional lymph node metastasis and later TNM stage(all P＜0.05).Although there were no significant differences in mRNA and protein expression of 4E-BP1 between tumor tissue and adjacent normal colorectal tissue,the phosphorylation level of 4E-BP1 was markedly increased in colorectal cancer tissue(P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis showed that the overall survival and progression-free survival of the p-4E-BP1 high expression group was significantly shorter than these of the low expression group(both P＜0.05).Cox proportional hazards model revealed that p-4E-BP1 was an independent adverse prognostic factor for both overall survival(RR=5.414,P＜0.05)and progression-free survival(RR=4.754,P＜0.05)in colorectal cancer patients.Conclusion High p-4E-BP1 expression is associated with tumor progression and adverse prognosis.p-4E-BP1 might serve as a novel biomarker to predict the clinical outcome of patients with colorectal cancer.

Colorectal cancer4E-BP1 Phosphorylation Clinicopathological features Prognosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-223

325027温州医科大学附属第二医院肝胆外科

王继生，E-mail：wenzhouwjs@163.com

2017-02-07）

（本文编辑：陈丹）