HIF-1α基因多态性与CO中毒患者急性期中枢神经损伤的相关性研究

李晟 刘伟 池学锋 谢雪蓓 陈潜妙 屠巍 吴赛华 张媛媛

HIF-1α基因多态性与CO中毒患者急性期中枢神经损伤的相关性研究

李晟 刘伟 池学锋 谢雪蓓 陈潜妙 屠巍 吴赛华 张媛媛

目的探讨低氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因多态性与一氧化碳（CO）中毒患者急性期中枢神经损伤的相关性。方法选择191例CO中毒患者，根据急性期头颅MRI结果（是否发生中枢神经脱髓鞘损伤）分为正常组105例与异常组86例。采用DNA直接测序HIF-1α基因中rs3783752、rs4899056、rs1957757、rs10873142等4个单核苷酸多态性位点。结果MRI异常组与正常组rs4899056基因型分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中异常组TT基因型分布频率较正常组低；两组患者rs10873142基因型分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中异常组CC基因型分布频率较正常组低。经连锁不平衡分析发现正常组单倍体基因型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度连锁（D'＞0.9，r2＞0.8），而异常组未发现连锁不平衡。MRI异常组与正常组患者定义为单倍体基因型块（rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142）的分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中CTTG单倍体基因型差异明显（P＜0.05），TCCA存在差异趋势（P=0.057）。结论HIF-1α基因多态性与CO中毒患者急性期中枢神经损伤具有相关性。

一氧化碳中毒低氧诱导因子-1α基因多态性中枢神经损伤

一氧化碳（CO）中毒会造成以中枢神经系统功能损害为主的多脏器病变，尤其是下丘脑、海马、大脑皮质神经元对缺血、缺氧十分敏感。MRI对早期脑组织细胞水肿、脱髓鞘改变较为灵敏，可以早期判断是否出现脑组织损伤。中枢神经损伤机制与许多因素有关，如中毒环境、治疗方案及遗传因素。哺乳动物体内的低氧诱导因子-1α（HIF-1α）是一种重要的氧调节因子，可以调节低氧相关因子表达。在缺血、缺氧过程中，HIF-1α的羟基化作用被扰乱，稳定性增强，发挥缺氧、缺血后的神经保护作用。故本文就HIF-1α基因多态性与CO中毒患者急性期中枢神经损伤的相关性作一探讨，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象选择2013年1月至2016年4月本院收治的191例CO中毒患者为研究对象。入选标准：（1）诊断标准参照国家颁布的《职业性急性CO中毒诊断标准及处理原则》；（2）既往无脑肿瘤及其他脑部合并症；（3）既往无其他昏迷病史及其他脏器功能衰竭。排除标准：（1）合并各种病因的脑卒中、严重心肺脑疾病及恶性肿瘤的患者；（2）治疗过程中发生CO中毒后迟发性脑病。根据急性期头颅MRI结果（是否发生中枢神经脱髓鞘损伤）分成正常组105例与异常组86例，两组患者年龄、性别以及碳氧血红蛋白、血常规、血清C反应蛋白、各项血生化指标等比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 方法记录所有患者一般特征（性别、年龄等）、中毒时间、家族情况。入院当天急诊查碳氧血红蛋白；第2天常规检测肝肾功能、心功能、血常规，采集清晨空腹静脉血以提取DNA；第2～7天行头颅MRI检查。

1.2.1 MRI检查所有患者行头颅MRI检查，并由2位高级职称的影像科医师记录并分析影像学资料。结果异常者在入院第8～10周复查MRI，2个月内若症状加重则立即复查。

1.2.2 HIF-1α基因SNP的选择基因多态性的检测5ml静脉血EDTA抗凝，使用上海祥音生物科技有限公司提供试剂盒提取DNA。从Hap Map数据库汉族人群群体中选择SNPs（http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/；public datarelease 24/phaseⅡ；Ⅱ），基于Tagger程序选择标签SNPs，定义参数为r2≥0.80和少见等位基因频率（MAF）≥5%。最终选取代表性的SNPs位点共4个（rs3783752、rs4899056、rs1957757、rs10873142）。使用Primer 5.0设计引物，见表1；采用直接测序方法读取个体的基因型。1.4统计学处理应用SPSS 20.0统计软件，采用χ2检验比较两组患者HIF-1α基因4个多态性位点（rs3783752、rs4899056、rs1957757、rs10873142）基因型分布频率的差异。HIF-1α基因各位点单核苷酸多态性连锁不平衡分析和单倍体基因型分析采用SHEsis在线自动分析系统，取D′值和r2值作为连锁不平衡指标。block根据D′＞0.9、r2＞0.8进行定义，再根据可信区间算法定义单倍体基因型块，使用期望最大算法估算各单倍体基因型频率，基因型频率＜3%的被排除，不再进行统计学检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 HIF基因SNPs位点分型所用引物及测序引物

2 结果

2.1 头颅MRI表现191例CO中毒患者急性期头颅MRI检查结果异常86例，主要表现为：（1）双侧皮质下白质和（或）侧脑室周同白质损害；（2）双侧基底节（主要为双侧苍白球）损害；（3）皮质下白质和（或）侧脑室周围白质与基底节同时受损害。MRI改变多为双侧对称性，点状、斑片状或融合病灶，T1WI呈低信号，T2WI、T2WFLAIR、DWI呈高信号。入院第8～10周复查MRI，白质病灶范围明显缩小，异常信号强度减弱，未发现其他病灶。

2.2 HIF-1α基因4个多态性位点的基因型分布频率HIF-1α基因多态性见图1-4。MRI异常组与正常组rs4899056基因型分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中异常组TT基因型分布频率较正常组低。两组患者rs10873142基因型分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中异常组CC基因型分布频率较正常组低，见表2。

2.3 连锁不平衡分析经连锁不平衡分析发现正常组单倍体基因型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度连锁（D′＞0.9，r2＞0.8），见图5a；异常组未发现连锁不平衡，见图5b。

2.4 单倍体分析根据SHEsis在线分析系统得出基因单倍体总数（患者例数×2-单倍体基因型频率＜3%的患者例数），即MRI异常组、正常组分别为172、210例。MRI异常组与正常组患者定义为单倍体基因型块（rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142）的分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中CTTG单倍体基因型差异明显（P＜0.05），TCCA存在差异趋势，见表3。

3 讨论

图1 HIF-1α（rs3783752）C/T基因多态性

图2 HIF-1α（rs4899056）C/T基因多态性

图3 HIF-1α（rs10873142）A/G基因多态性

图4 HIF-1α（rs1957757）C/T基因多态性

图5 连锁不平衡分析结果（a：正常组；b：异常组）

表2 MRI异常组与正常组HIF-1α基因4个多态性位点的基因型分布频率比较[例（%）]

表3 MRI异常组与正常组HIF-1α基因多态性单倍体分析结果[例（%）]

CO中毒性脑病通常有明确的CO中毒史，临床表现主要有意识不清或意识模糊、头晕头痛、胡言乱语、行走困难、反应迟钝及四肢抽搐等。急性中毒迟发性脑病是其常见的并发症[1-2]，而高压氧是其首选治疗方法。CO中毒性脑病患者中枢脱髓鞘损伤的病理过程较为复杂，常规MRI、DWI能够从病变范围对脑损伤程度进行评估[3]。目前认为CO中毒性脑病是由于缺血、缺氧导致脑组织坏死和血－脑脊液屏障开放，从而激发严重免疫反应性髓鞘受损。本文对温州地区191例患者的发病情况进行分析，CO中毒后急性期中枢神经系统脱髓鞘改变情况与性别、年龄、碳氧血红蛋白、CO中毒严重程度等因素均无关；这提示不同个体在CO中毒后的解毒、免疫损伤、神经细胞凋亡及损伤后保护能力、细胞缺氧耐受能力均存在个体差异，推测个体遗传因素可能起到关键作用。HIF-1α是一类介导低氧适应性反应的转录因子，能激活许多低氧反应基因表达，是低氧条件下维持体内氧稳态的关键性物质。研究表明在常氧条件下，HIF-1α通过降解结构域脯氨酸残基羟基化，激活细胞内氧依赖的泛素，并通过蛋白水解酶降解通路使低氧反应相关性蛋白迅速降解[1，4]。在缺血、缺氧过程中，HIF-1α的羟基化作用被扰乱，稳定性增强，通过调控血管内皮生长因子、促红细胞生成素、促凋亡蛋白半胱天冬酰胺酶3等靶基因表达，促进脑血流动力学的恢复、改善细胞能量代谢、抑制细胞凋亡，发挥缺氧、缺血后的神经保护作用。

HIF-1α亚基编码基因位于人类染色体14q21-24，含15个外显子和14个内含子。国内研究发现海拔高度不同引起的低氧环境差异可能对HIF1-α基因有选择作用，且与多种疾病如糖尿病合并视网膜病变、脑梗死等相关[4-6]。根据中国汉族人群HIF-1α基因多态性特点，本研究最终选取4个有代表性的SNP位点（rs3783752、rs4899056、rs1957757、rs10873142），结果显示在rs4899056位点，头颅MRI异常组TT基因型分布频率明显低于正常组；在rs10873142位点，头颅MRI异常组GG基因型分布频率低于正常组。提示HIF-1α基因rs4899056、rs10873142两个位点的变异与CO中毒后中枢神经脱髓鞘损伤有关，基因变异引起相关编码蛋白的氨基酸序列改变，从而影响相关HIF蛋白功能表达的稳定性和功能。此外，本研究作连锁不平衡分析发现，正常组单倍体基因型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度连锁，异常组未发现连锁不平衡；作单倍体分析发现，单倍体基因型块（rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142）CTTG单倍体基因型两组差异明显，即正常组高于异常组，而TCCA单倍体基因型存在差异趋势。故笔者初步考虑温州地区人群CTTG单倍体基因型对CO中毒后中枢神经脱髓鞘损伤有一系列保护机制。

综上所述，HIF-1α基因多态性与CO中毒患者中枢神经损伤具有相关性。但本文尚存在一些不足：（1）难以获得准确的昏迷时间、中毒时间等，仅以碳氧血红蛋白含量为客观依据；（2）缺少可能影响HIF-1基因下游相关因子的研究，系统阐述CO中毒后中枢神经脱髓鞘机制；（3）研究样本量相对较小。建议今后作更大样本的研究，以进一步验证。

[1] Brill C,Scheuer T,Bhrer C,et al.Oxygen impairs oligodendroglial development via oxidative stress and reduced expression of HIF-1α[J].Sci Rep,2017,7:43000.

[2] Guan L,Wen T,Zhang Y,et al.Induction heme oxygennase-1 with hemin attenuates hippocampal injury in rats after acute carbon monoxide poisoning[J].Toxicology,2010,262(2):144-146.

[3] 郭军,孟郊,韩彤.一氧化碳中毒与中毒后迟发性脑病的大脑磁共振成像比较[J].中华劳动卫生职业病杂志,2014,32(7):533-536.

[4] 赵静,庄彦.运用随机森林分析糖尿病视网膜病变的影响因素与HIF-1α基因多态性的关系[J].2016,38(23):1871-1875.

[5] 陈捷,林蕾.HIF-1α基因多态性与大动脉粥样硬化型脑梗死的相关性研究[J].浙江医学,2014,36(23):1917-1920.

[6] Eskandani M,Vandghanooni S,Barar J,et al.Cell physiology regulation by hypoxia inducible factor-1:targeting oxygenrelated nanomachineries of hypoxic cells[J].Int J Biol Macromol,2017(16):31255-31257.

Association of HIF-1α gene polymorphism with central nervous injury in patients with acute carbon monoxide poisoning

LI Sheng,LIU Wei,CHI Xuefeng,et al.
Department of Neurology,the 118th Chinese People's Liberation Army Hospital,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the association between HIF-1α gene polymorphism and central nervous injury in patients with acute carbon monoxide poisoning.MethodsOne hundred and ninety one patients with carbon monoxide poisoning in acute stage were enrolled in the study,including 86 cases with central nervous injury according to MRI examination.The single nucleotide polymorphisms of HIF-1α gene rs3783752,rs4899056,rs1957757 and rs10873142 loci were detected with DNA direct sequencing.Results The frequencies of TT genotype in rs4899056 and GG genotype of rs10873142 in MRI abnormal group were significantly lower than those in MRI normal group(both P＜0.05).The linkage disequilibrium analysis found that haploid type(rs3783752-rs4899056-rs1957757)in normal group had high linkage(D'＞0.9,r2＞0.8),while not in abnormal group.There were significant differences in haploid type(rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142)between patients with abnormal MRI and normal MRI(P＜0.05),the significant difference was found in CTTG haploid type(P＜0.05),while the difference trend was found in TCCA haploid type(P=0.057).Conclusion HIF-1α gene polymorphism is related to central nerve damage in patients with carbon monoxide poisoning.

Carbon monoxide poisoning Hypoxia inducible factor-1aGene polymorphism Central nerve injury

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-533

温州市公益性科技计划项目（Y20150168）

325000温州，中国人民解放军第一一八医院神经内科（李晟、刘伟、池学锋），检验科（谢雪蓓），影像科（陈潜妙、张媛媛），神经康复科（屠巍），急诊科（吴赛华）

李晟，E-mail：lisheng_216@163.com

2017-03-13）

（本文编辑：陈丹）