胃癌组织中TS和β-Tubulin的表达研究

江雨璐 张敏 王亮 何杰

（安徽省肿瘤医院病理科，合肥 230032）

胃癌组织中TS和β-Tubulin的表达研究

江雨璐 张敏 王亮 何杰

（安徽省肿瘤医院病理科，合肥 230032）

目的：检测胃癌组织中胸苷酸合成酶（TS）和β微管蛋白（β-Tubulin）mRNA的表达情况，探讨其临床意义。方法：应用实时逆转录PCR技术对胃癌组织和相应癌旁正常胃组织的TS和β-Tubulin的mRNA进行检测，分析TS和β-Tubulin mRNA表达与临床病理特征的关系及两者之间的相关性。结果：胃癌组织TS、β-Tubulin的mRNA高表达率与正常胃组织比较，差异有统计学意义；不同分化程度、不同浸润深度的胃癌组织标本β-Tubulin高表达率差异具有统计学意义（P＜0.05）；TS和β-Tubulin mRNA表达之间呈弱正相关。结论：胃癌组织中TS、β-Tubulin表达高于正常胃组织，且低分化程度和浸润深度高的胃癌组织中β-Tubulin表达高于高分化程度和浸润程度低的胃癌组织。

胃癌；胸苷酸合成酶；β微管蛋白

胸苷酸合成酶（TS）是核酸及氟尿嘧啶体内代谢通路的关键酶[1]，β微管蛋白（β-Tubulin）可参与细胞的物质运输、有丝分裂及形状改变等多个环节[2]，两种分子标志物在乳腺癌、食管癌、肺癌等多种恶性肿瘤诊断及疗效预测中的价值已得到广泛认可[3-4]。此次研究使用实时逆转录PCR技术（quantitative Real-time RT-PCR）检测胃癌组织中TS和β-Tubulin的mRNA表达，探讨其临床参考价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

此次研究采用回顾性对照分析方法。选取我院2014年5月至2016年12月收治的95例胃癌患者，均行手术切除，临床资料完整，术前均未接受放、化疗。95例患者中，男77例，女18例，年龄20～81岁，平均（59.87±11.63）岁，临床分期：IA期6例，IB期8例，IIA期7例，ⅡB期13例，ⅢA期12例，ⅢB期26例，IIIC期15例，Ⅳ期8例；分化程度：高分化14例，中分化48例，低分化33例；浸润深度：T1期9例，T2期12例，T3期17例，T4期57例。

1.2 标本检测

1.2.1 检测方法 术中取癌、癌旁正常胃组织，石蜡包埋切片，使用实时逆转录PCR检测95例胃癌组织和相对应正常胃组织标本TS、β-Tubulin的mRNA表达情况。石蜡组织RNA提取试剂盒由OMEGA公司提供，逆转录试剂盒和SybrGreen荧光染料，均由ABI公司提供。主要操作步骤：1）使用TS、β-Tubulin特异性引物，从总RNA逆转录cDNA：10×RTmix、TS或β-Tubulin特异性引物、dNTPs、H2O各1.6 μL，RNase抑制剂、RNase各0.8 uL，加上稀释后个总RNA 8 uL，反应体积共16 μL。反应程序 ：25℃ 10 min，42℃ 6 min，94℃ 5 min，4℃冷却 8 min。2）于毛细玻璃管内以特异性双标荧光探针及特异基因引物在定量PCR仪上行PCR扩增反应，总反应体积为20 μL，其中FastStart反应混合液2 μL，TS、β-Tubulin检测混合液 6 μL，MgCL225 mmol/L，H2O 6.4 μL，cDNA 4 μL。扩增程序：95℃预孵5 min，95℃变性、62℃退火、72℃延伸各10 s，循环40次；40℃冷却30 s。引物如下：

β-Actin-F: AGCCATGTACGTTGCTATCCA

β-Actin-R: GTCACCGGAGTCCATCACGAT

TS-F: ACCAACCCTGACGACAGAAG

TS-R: CATGTCTCCCGATCTCTGGT

β-Tubulin-F:GCTGCA ACTTCACAAGGTCAAG

β-Tubulin-R: CTCGCCTCACCTCTGTTTTC

1.2.2 结果判读 以与TS、β-Tubulin基因扩增动力学相似的β-actin作为内参照，每样本重复3次，2-△△CT法进行比较，当2-△△CT≥2时，判定为高表达，＜2判定为低表达。

1.3 分析方法

数据运用SPSS19.0软件统计分析，不同临床病理特征组织标本TS和β-Tubulin的mRNA表达采用χ2检验，TS和β-Tubulin的mRNA表达之间的关系用Spearman等级相关分析。

2 结果

胃 癌 组 织 TSmRNA 高 表 达 率 27.36%（26/95），β-Tubulin mRNA高表达率33.68%（32/95）。癌旁正常胃组织TS mRNA高表达率2.1%（2/95）、β-Tubulin mRNA高表达率1.05%（1/95）。胃癌组织TS、β-Tubulin mRNA高表达率与正常胃组织比较，差异有统计学意义。

不同分化程度、不同浸润深度患者的胃癌组织标本的β-Tubulin高表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 胃癌组织标本TS和β-Tubulin高表达率与临床病理特征的关系

如表2所示，TS和β-Tubulin的mRNA表达之间弱正相关，r=0.491，P＜ 0.05。

表2 TS和β-Tubulin的mRNA表达相关性分析

3 讨论

我国每年新发胃癌患者约40万，约占世界胃癌新发患者的40%以上，即便给予规范、系统、有效的治疗，患者仍有较高的死亡率和复发、转移风险[10-11]。因此，对胃癌早期筛查诊断及疗效预测分子标志物的探索一直在进行。

TS是胸苷酸合成的起始酶，与肿瘤DNA的合成速度具有密切关联性，也被认为是氟尿嘧啶类药物的主要作用靶点，且其表达情况与非小细胞肺癌患者化疗药物的敏感性密切相关[12]。此次研究胃癌组织中TS高表达率27.36%，而正常组织TS高表达率为2.10%。有研究报道印戒细胞癌病灶组织TS阳性率达到100%[13]，其可能是促进印戒细胞癌发生、进展的重要分子标志物，由于TS是DNA合成环节中的重要限速酶，TS过度表达的癌细胞往往具有较高的生长潜能[14]。过往有学者就TS对胃癌化疗效果的临床预测价值进行了分析，得到结论为TS阴性者较TS阳性者有着更高的化疗有效率，其原因与TS调节P53表达从而影响细胞周期、肿瘤细胞增殖的机制有关[15]。但本研究未就癌症病理分型进行分析，可能TS高表达的印绒细胞癌占比较少，未显现出TS高表达与临床分期及浸润深度的相关性。

作为紫杉醇类药物的作用靶点，β-Tubulin与细胞增殖、分化以及肿瘤的发生发展密切相关[16]。Ma等[17]报道恶性肿瘤组织β-Tubulin III高表达提示预后不良。本研究中胃癌组织标本β-Tubulin高表达与肿瘤分化程度、浸润深度相关，其敏感性高于TS。在临床疗效观察中，已有报道β-Tubulin表达改变可对使患者DFS、OS明显缩短，其原因可能与细胞骨架结构稳定性下降、动力性上升有关[18]。

综上所述，胃癌组织中TS和β-Tubulin均呈高表达状态， TS、β-Tubulin表达情况的观察，对于胃癌的深入诊断有着积极作用，后续可重新设计实验观察二者与临床疗效及预后的关系。

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R365

A

2095-5200(2017)06-068-03

10.11876/mimt201706027

江雨璐，本科，主管技师，研究方向：病理临床，Email：1473252585@163.com。

何杰，博士，主任医师，教授，博士生导师。