CDKN2B-AS1基因多态性与女性早发冠心病的相关性研究

乔琳，文星艳，窦克非，尹栋，宋卫华，张禅那，孙凯，惠汝太，王虹剑

冠心病研究

CDKN2B-AS1基因多态性与女性早发冠心病的相关性研究

乔琳，文星艳，窦克非，尹栋，宋卫华，张禅那，孙凯，惠汝太，王虹剑

目的：探讨CDKN2B-AS1 基因位点rs4977574单核苷酸多态性（SNP）与女性早发冠心病的相关性。 方法：采用病例对照研究，连续入选女性早发（＜65岁发病）冠心病患者226例（病例组）和同期冠状动脉造影阴性、年龄匹配的女性患者79例（对照组），采用小测序法（SNaPshot技术）检测CDKN2B-AS1基因位点rs4977574多态性，同时测定血浆中总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）、血尿酸（UA）、空腹血糖（FPG）及糖化血红蛋白（HbA1c）水平，评估rs4977574多态性与上述生物标志物的相关性。 结果：与对照组相比，病例组血TG、UA、FPG、HbA1c水平明显升高（P＜0.05），校正年龄、体重指数、相关病史及危险因素后，高HbA1c（HbA1c＞6.2%）明显增加女性早发冠心病的发生风险（OR=3.35，95%CI：1.41～8.00，P=0.006）； rs4977574基因型及等位基因频率在病例组和对照组中分布有显著差异（P＜0.05），病例组等位基因G频率明显高于对照组（OR=1.24，95%CI：1.05～1.48，P=0.019）。进一步分析发现，rs4977574多态性与高HbA1c相关；与AA基因型受试者相比，（GG+GA）基因型受试者中高HbA1c的发生率明显增加（OR=2.08，95%CI：1.11～3.89，P=0.022）。 结论：CDKN2B-AS1基因SNP位点rs4977574多态性与女性早发冠心病相关，并与高HbA1c相关。

冠状动脉疾病；基因；女（雌）性

临床上将女性冠心病发病时年龄不超过65岁，称为早发冠心病[1]。目前针对女性早发冠心病的研究相对较少，其相关危险因素及发病机制尚不明确。遗传易感性是冠心病发生的独立危险因素，研究易感基因多态性与女性早发冠心病的相关性，对于揭示女性早发冠心病的发病机制具有重要意义。既往研究发现，9p21染色体与冠心病发病的遗传机制紧密相关[2]。其中，9p21.3区域中CDKN2B-AS1 基因单核苷酸多态性（SNP）位点rs4977574与冠心病的相关性在欧洲人群中已经得到证实[3]，但在国内少有文献报道。本研究旨在探讨CDKN2B-AS1 基因多态性与女性早发冠心病及其临床特点的相关性。

1 资料与方法

研究对象：2014-01至2015-12期间连续入选因胸痛在中国医学科学院阜外医院住院并接受择期冠状动脉造影的女性患者305例。患者年龄均＜65岁，其中早发冠心病患者226例（病例组），入选标准：经冠状动脉造影证实左主干狭窄＞30%或其他3支（前降支、回旋支、右冠状动脉）及其主要分支中至少1支冠状动脉狭窄≥50%；另有79例经冠状动脉造影证实血管无病变（对照组）。排除标准：恶性疾病、严重肾功能衰竭、肝功能障碍、严重瓣膜病、心肌病、血液病、妊娠和急性感染。所有研究对象均于入院后详细记录一般特征、心血管病相关危险因素及疾病史。经由中国医学科学院阜外医院伦理委员会批准本项研究。

实验室检查指标测定：所有研究对象于冠状动脉造影前空腹（8小时以上）采集外周静脉血。总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）、尿酸（UA）、空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）等血液生化指标用血生化分子分析仪AUS5400（奥林巴斯，日本）进行测定。其中高TG定义为TG水平＞1.76 mmol/L，高UA定义为血UA水平＞416.5µmol/L，高FPG定义为FPG水平＞6.1 mmol/L，高HbA1c定义为HbA1c水平＞6.2%。

DNA提取及基因SNP检测：采集生化指标检测用血同时，使用EDTA抗凝真空采血管采集4ml外周血，应用TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒提取外周血DNA，-80℃保存。SNP检测采用分型技术（SNaPshot技术，也称小测序），首先将包含目的SNP位点的基因片段扩增，然后通过延伸反应将SNP位点碱基再次扩增（二次扩增）。延伸反应中引物延伸一个碱基即终止，经测序仪检测，根据峰的颜色得知掺入的碱基种类，从而确定样本基因型。扩增反应：以DNA为模板扩增含有SNP位点的DNA片段，使用引物为F：GGGTTATGGGAAATGCCATG，R：TTGCTGAAGGGACTCAATGAGAG，聚合酶链式反应（PCR）总反应体系10 µl，包含2.5倍标准缓冲液Ⅳ 4 µl，10～20 ng/µl DNA 液 2 µl，5 µmol引物 1.5µl，5U/ µl卡帕热启动 DNA 聚合酶 0.15 µl，蒸馏水补齐至 10 µl，反应条件为 95℃、5 min；95℃、30 s，53℃、30 s，72℃、30 s，30 个循环；72℃，10 min。扩增产物质检：取2 µl上样，2%琼脂糖凝胶电泳。扩增产物纯化：于15 µl PCR产物中加入5 µl虾碱性磷酸酶和2 µl核酸外切酶Ⅰ，纯化程序为37℃、1.0 h，75℃、20 min。延伸反应（二次扩增）：使用引物为F：GGGTACATCAAATGCATTCTATAGC，总反应体系5 µl，包含纯化后扩增产物 1.2 µl，0.2 µmol/L 引物混合物2 µl，荧光混合物0.5 µl，10倍标准缓冲液I 0.4 µl，蒸馏水补齐至 5 µl，反应条件为 96℃、10 s，53℃、5 s，60℃、30 s，30个循环。延伸产物纯化：取延伸反应产物10 µl，加入1 µl小牛肠碱性磷酸酶，纯化程序为37℃、1.0 h，75℃、15 min。DNA测序仪测序：96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液（0.5：8.5）9 µl，延伸反应纯化产物 1.0 µl，总体积10 µl，95℃变性5 min，迅速冰冷4 min，于ABI 3730XL型DNA序列检测仪上进行毛细管电泳。

统计学分析：应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料以频数和百分比表示，计量资料以平均值±标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验或χ2检验。Hardy-Weinberg平衡检验、各组间基因型频率分布和等位基因频率分布比较使用χ2检验。危险因素分析应用多元Logistic回归，把年龄、高血压病史、高脂血症病史、糖尿病病史、吸烟史、饮酒史作为校正因素引入分析。双侧P值＜0.05视作差异有统计学意义。

2 结果

两组受试者的一般临床特征比较（表1）：本研究共入选研究对象305例，其中病例组226例，对照组79例。两组在年龄、体重指数、TC、LDL-C及HDL-C等方面的差异均无统计学意义（P均＞0.05）。与对照组相比，病例组高血压病、高脂血症及糖尿病的患病率明显增高，血压、TG、UA、FPG及HbA1c水平亦明显升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

表1 两组受试者的一般临床特征比较

表1 两组受试者的一般临床特征比较

注：1 mmHg=0.133 kPa

生物标志物与女性早发冠心病的相关性分析（表2）：校正年龄、高血压病史、高脂血症病史、糖尿病史、体重指数、早发冠心病家族史、吸烟史和饮酒史后，高 HbA1c（OR=3.35，95%CI：1.41～8.00，P=0.006） 和 高 FPG（OR=3.49，95%CI：1.38～8.84，P=0.008）明显增加女性早发冠心病的发生风险。

表2 生物标志物与女性早发冠心病的相关性分析[例(%)]

两组受试者rs4977574基因型和等位基因频率分布：两组经拟合优度χ2检验均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。病例组rs4977574的GG、GA、AA3种基因型分布与对照组比较（30.5% vs 22.8%；50.4% vs 44.3%；19.0% vs 32.9%），差异有统计学意义（P=0.036）；病例组等位基因G频率明显高于对照组（55.8% vs 44.9%，P＜0.05）。

rs4977574基因多态性与女性早发冠心病的相关性分析：校正年龄、高血压病史、高脂血症病史、糖尿病史、体重指数、早发冠心病家族史、吸烟史、饮酒史等潜在混杂因素后，（GG+GA）基因型受试者相对于AA基因型受试者发生早发冠心病的风险升高（OR=1.87，95%CI：1.03～3.39，P=0.040）；携带等位基因G的受试者发生早发冠心病的风险明显增加（OR=1.24，95%CI：1.05～1.48，P=0.019）。

rs4977574多态性与生物标志物的相关性分析（表3）：进一步分析rs4977574多态性与TG、UA、FPG及HbA1c等生物标志物之间的关系发现，rs4977574多态性与高HbA1c显著相关。在全部研究对象中，（GG+GA）基因型（236例）和AA基因型（69例）的HbA1c水平分别为（6.48±1.38）% 和（6.30±1.44）%，差异无统计学意义（P＞0.05）；校正年龄、高血压病史、高脂血症病史、糖尿病史、体重指数、早发冠心病家族史、吸烟史、饮酒史后，（GG+GA）基因型受试者出现高HbA1c的风险明显增高（OR=2.08，95%CI：1.11～3.89，P=0.022）。

表3 rs4977574多态性与生物标志物的相关性分析

表3 rs4977574多态性与生物标志物的相关性分析

注：HbA1c：糖化血红蛋白；FPG：空腹血糖；UA：血尿酸；TG：甘油三酯。-：无。校正因素：年龄、高血压病史、高脂血症病史、糖尿病史、体重指数、早发冠心病家族史、吸烟史、饮酒史

3 讨论

本研究发现，CDKN2B-AS1基因位点rs4977574多态性与女性早发冠心病相关，携带等位基因G的女性更易发生早发冠心病；另外，SNP位点rs4977574多态性与血糖水平相关，（GG+GA）基因型受试者中高HbA1c的发生率明显增加。因为高HbA1c和高FPG可增加女性早发冠心病的发生风险，我们推测rs4977574多态性可能通过影响血糖代谢而与女性早发冠心病易感性相关。

本研究目标基因CDKN2B-AS1位于9p21.3染色体上，该基因全长126.3kb，可转录成一段长约3834bp的与INK4b-ARF-INK4a基因座呈转录反义方向的RNA，即ANRIL。相关研究表明，含有风险SNP位点的外周血单核巨噬细胞内CDKN2BAS1 基因表达水平升高，并可发生细胞增殖、黏附增加等能导致动脉粥样硬化形成的生物学行为[4]。

国内外研究发现，CDKN2B-AS1基因多态性（rs4977574）可能参与冠心病的发生、发展。Rivera等[5]和Pechlivanis等[6]针对加拿大和部分欧洲人群开展的研究显示，SNP位点rs4977574与冠心病的严重程度以及糖尿病相关。在中国人群中，rs4977574与心肌梗死密切相关[7]。黄毅[8]对浙江宁波汉族人群的研究发现，rs4977574与冠心病显著相关，且在该地区65岁以下女性人群中表现出了高致病风险（基因型P=0.01, 等位基因P=0.01, OR=1.70）。这与本研究结果相似。然而，rs4977574参与冠状动脉粥样硬化特别是女性早发冠心病发生、发展的机制尚不清楚。周香等[9]对早发冠心病与晚发冠心病危险因素的研究显示，血糖代谢异常（OR=1.98）增加早发冠心病的风险。既往关于女性早发冠心病的研究表明，高HbA1c水平是发病的危险因素（OR=4.341）[10]。另有研究推测，糖尿病、高脂血症可通过引起外周血白细胞端粒缩短而与早发冠心病相关[11]。本研究发现，rs4977574多态性与HbA1c水平相关，推测rs4977574多态性可能参与血糖代谢的调节。有研究发现，受风险SNP位点的影响，CDKN2B-AS1 基因的某些特定转录产物可调节ADIPORl、VAMP3、C11ORF10等基因的表达，而上述基因在血糖、血脂等代谢活动调控中发挥重要作用[12]。由此我们推测，rs4977574可能通过相关信号通路影响血糖代谢而参与女性早发冠心病的发生、发展。

综上所述，CDKN2B-AS1基因rs4977574多态性与女性早发冠心病相关，等位基因G是女性早发冠心病的易感基因，SNP位点rs4977574多态性与血糖水平相关，携带等位基因G的患者更易出现血糖水平升高。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究采取连续入选的方式入选住院进行冠状动脉造影的女性患者，研究对象较少，样本量相对有限，有可能使结果的外推有一定局限性；其次，本研究入选病例大多为居住在北方地区的汉族人群，不能排除地域分布、种族差异对基因多态性造成的影响；第三，本研究为横断面研究，只能探讨基因多态性和疾病的相关性而不能推出因果关系。

因此，我们计划在今后的研究中进一步扩大样本量，在不同种族的人群中进行验证，并完成病例随访，以明确CDKN2B-AS1 基因多态性、相关生物标志物与女性早发冠心病患者远期预后的关系，为女性早发冠心病的发现和治疗提供更多的理论依据。

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Correlation Study Between CDKN2B-AS1 Gene Polymorphism and Female Premature Coronary Artery Disease Occurrence

QIAO Lin, WEN Xing-yan, DOU Ke-fei, YIN Dong, SONG Wei-hua, ZHANG Chan-na, SUN Kai, HUI Ru-tai, WANG Hong-jian.
Department of Cardiology, National Center for Cardiovascular Disease and Fuwai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037),China

WANG Hong-jian, Email: wanghongjianfw@hotmail.com

Objective:To explore the relationship between single nucleotide polymorphism (SNP) rs4977574 in CDKN2B-AS1 gene and female premature coronary artery disease (pCAD) occurrence.

Methods: Our research included 2 groups: pCAD group, n=226 consecutive patients≤65 years of age and Control group,n=79 subjects with matched age,without CAD. The genotype of CDKN2B-AS1 SNP rs4977574 was detected by SNaPshot.Blood levels of total cholesterol (TC), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C), triglycerides (TG), uric acid (UA), fasting plasma glucose (FPG) and glycosylated hemoglobin (HbA1c) were examined; relationships between rs4977574 polymorphism and the above parameters were assessed.

Results: Compared to Control group, pCAD group had increased blood levels of TG, UA, FPG and HbA1c, P＜0.05.With adjusted age, body mass index (BMI), relevant disease history and risk factors, elevated HbA1c (HbA1c＞6.2%)obviously increased the risk of female pCAD occurrence (OR=3.35, 95%CI 1.41-8.00, P=0.006). The genotype and allele frequency of rs4977574 were different between pCAD group and Control group, P＜0.05. Compared to Control group, pCAD group had the higher frequency of G allele(OR=1.24, 95%CI 1.05-1.48, P=0.019); further analysis found that rs4977574 polymorphism was related to high HbA1c. Compared to AA genotype, GG+GA genotype had the increased incidence of high HbA1c(OR=2.08, 95%CI 1.11-3.89, P=0.022).

Conclusion: CDKN2B-AS1 SNP rs4977574 was related to female pCAD occurrence and it was also related to high HbA1c.

Coronary artery disease; Gene; Female

国家自然科学基金青年科学基金项目（81300156）；协和青年基金和中央高校基本科研业务费专项资金（3332015103）

100037 北京市，北京协和医学院 中国医学科学院 国家心血管病中心 阜外医院 心内科

乔琳 硕士研究生 研究方向：女性早发冠心病 Email:1262796884@qq.com 通讯作者：王虹剑 Email: wanghongjianfw@hotmail.com

R54

A

1000-3614（2017）12-1154-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.12.003

(Chinese Circulation Journal, 2017, 32:1154.)

2017-05-04）

（编辑：朱柳媛）