豨签草中总黄酮测定方法和提取工艺研究

2017-12-20李文恋陈双民刘珍珍

长江大学学报(自科版) 2017年24期

关键词：中总芦丁光度

李文恋，陈双民，刘珍珍

(长江大学医学院，湖北荆州 434023)

[引著格式]李文恋，陈双民，刘珍珍. 豨签草中总黄酮测定方法和提取工艺研究[J]. 长江大学学报(自科版), 2017,14(24):7～10.

豨签草中总黄酮测定方法和提取工艺研究

李文恋，陈双民，刘珍珍

(长江大学医学院，湖北荆州 434023)

目的：优化豨莶草总黄酮提取工艺，为豨莶草的综合开发与利用提供参考依据。方法：采用回流提取法对豨莶草中总黄酮进行提取，单因素实验考察不同乙醇浓度(0%、30%、50%、75%和95%)，料液比(1∶10、1∶15、1∶20和1∶25g/mL)和提取时间(30min、1、1.5h和2h)对总黄酮提取效果的影响，并用Al(NO3)3络合法测定豨莶草总黄酮的含量。结果：确定最佳提取工艺条件为水提，料液比 1∶15(g/mL)，提取时间1h，在此提取条件下测定豨莶草中总黄酮的含量1.71%。结论：该提取工艺经济、稳定、可行，为豨莶草进一步研究与开发提供依据。

豨莶草；总黄酮；Al(NO3)3络合法；提取工艺

豨签草别名肥猪草、粘糊菜、黄花仔等，为菊科植物豨签(Siegesbeckia orientalis L)、腺梗豨莶(Siegesbeckia pubescens Makino)或毛梗豨莶(Siegesbeckia glabrescens Makino)的干燥地上部分，收录于2015年版《中药药典》[1]。豨莶草味辛、苦，性寒，归肝、肾经，具有祛风湿，利关节[2]，清热解毒，降血压[3]等功能，临床上主要用于治疗风湿痹痛，筋骨无力，腰膝酸软，四肢麻木，半身不遂，风疹湿疮等症。目前，从豨签草中已经分离得到的主要化学成分包括二萜类、倍半萜类和黄酮类等化合物[4]，其中豨莶草中二萜类、倍半萜类化合物含量测定与药理作用已有文献报道[5～9]，但关于黄酮类化合物的提取和作用研究较少。目前测定总黄酮类化合物的方法主要有薄层色谱法、紫外分光光度法和HPLC法[10]，而紫外分光光度法是最常用、灵敏度高、操作简单快速的总黄酮检测方法。紫外分光光度法包含Al(NO3)3络合法、AlCl3法和盐酸-镁粉法等显色法。柴建新、倪晓霞和何婷等[11～15]研究表明，Al(NO3)3络合法的测定结果准确度相对较高。本文以芦丁为对照品，以豨签草总黄酮含量为评价指标，考察了提取时间、料液比和乙醇浓度等因素对豨签草总黄酮提取的影响，优化了豨莶草中总黄酮的提取方法并对其含量进行了测定。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；XFB-200高速中药粉碎机(中国吉首市中诚制药机械厂)；AL104电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；DZTW调温电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司)；Centrifuge 5810R离心机(艾本德中国有限公司)；芦丁(HPLC≥98%，北京索莱宝科技有限公司)；硝酸铝，亚硝酸钠，氢氧化钠，乙醇等均为分析纯；蒸馏水。豨莶草(生产批号：1505019037)购自于荆州市中医院药房。

1.2 实验方法

1)对照品溶液的制备精确称取干燥恒重的芦丁对照品12.50mg，置于50mL 量瓶中，加50% 乙醇溶液溶解并定容，摇匀，即得浓度为 0.25mg/mL 芦丁对照品储备液，备用。

2)豨莶草总黄酮的提取工艺精密称取豨莶草药材粉末(过40目筛)5.0g，置于250mL 圆底烧瓶中，在不同乙醇体积分数(0%、30%、50%、75%和95%)、液料比(1∶10、1∶15、1∶20和1∶25g/mL)、提取时间(30min、1、1.5h和2h)条件下回流提取豨莶草总黄酮。同种条件下，回流提取两次，抽滤，合并滤液，浓缩后，加50%的乙醇溶解定容至100mL，得供试品溶液。

3)吸收波长测定取配制好的对照品溶液5mL和豨莶草供试品溶液1mL分别置于25mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0mL，摇匀放置6min；然后加入10%的Al(NO3)3溶液 1.0mL，摇匀放置6min；再加4% NaOH溶液10.0mL，加水稀释至刻度线，摇匀，避光放置45min后，在400～600nm波长范围内进行扫描，确定其最大吸收波长

4)标准曲线的制备分别精密吸取芦丁储备液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于25mL的容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0mL，摇匀放置6min；然后加入10%的Al(NO3)3溶液 1.0mL，摇匀放置6min；再加4% NaOH溶液10.0mL，加水稀释至刻度线，摇匀，避光放置45min后，以0号溶液为空白分别测定上述标准溶液在其最大吸收波长510nm处的吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

5)豨莶草总黄酮的含量测定精密称取6份5.0 g豨莶草药材粉末，按“豨莶草总黄酮提取的工艺”项下操作，精密移取1.0mL，按“标准曲线的制备”项方法操作，测定吸光度值，并代入回归方程计算豨莶草样品中总黄酮含量。

2 结果

2.1 最大吸收波长的确定

芦丁标准溶液和豨莶草样品溶液显色后在400 ～ 600nm扫描测定。结果表明：豨莶草提取液与芦丁对照品溶液在510nm波长处有最大吸收值。

2.2 方法学考察结果

图1 芦丁标准曲线

1)线性范围与标准曲线以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示，得到回归方程为：y= 12.982x-0.0013(r= 0.9997)，线性范围为0～0.06mg/mL。此法试剂配制简单、操作简便快捷、反应灵敏，适合于豨莶草总黄酮含量的定量分析。

2)精密度试验精密吸取芦丁对照品溶液4mL置于25mL量瓶中，按“标准曲线的制备”项下的方法操作，对该试样进行6次重复测定，吸光度分别为0.527、0.528、0.528、0.527、0.526、0.527，平均吸光度为0.527，RSD为0.14%，表明仪器精密度良好。

3)重复性试验取同批药材样品，准确称定5. 0g，按“豨莶草总黄酮的提取工艺”项下相同制备方法平行制备6份，分别精密移取1.0mL置于25mL量瓶中，按“标准曲线的制备”项方法操作，分别测定吸光度值为0.435、0.441、0.451、0.445、0.447、0.438，平均吸光度为0.443，RSD为1.34%，表明实验重复性良好。

4)稳定性试验精密吸取豨莶草供试液1mL置25mL量瓶中，按“标准曲线的制备”项方法操作，每隔10min对该试样进行测定一次，吸收度分别为0.448、0.454、0.453、0.459、0.452、0.447，平均值为0.452，RSD为0.96，表明供试品溶液在1h内稳定。

5)回收率实验精密称取已测知含量的豨莶草，加入对照品，按照“豨莶草总黄酮的提取工艺”项方法配制供试品溶液，按“标准曲线的制备”项下方法操作，测得回收率，结果如表1所示。

表1 加样回收率试验

2.3 豨莶草总黄酮的含量测定

1)乙醇体积分数对豨莶草总黄酮的提取效果精密称取6份5.0g豨莶草药材粉末，按料液比1∶15(g/mL)分别加入水，30%，50%，75%和95%乙醇，浸泡30min后，回流提取1h。重复提取两次，合并滤液，浓缩后，加50%的乙醇溶解定容至100mL，精密移取1.0mL，按“标准曲线的制备”项方法操作，测定吸光度值，结果如图2所示。随着乙醇体积分数的增大，豨莶草总黄酮的含量缓慢减少，虽75%乙醇提取黄酮含量有所增加，但总体都不如水提取的黄酮含量多，因此确定了水为豨莶草总黄酮提取的最佳溶剂。

图2 乙醇体积分数对豨莶草总黄酮提取的影响图3 料液比对豨莶草总黄酮提取的影响

图4 回流提取时间对豨莶草总黄酮提取的影响

2)料液比对豨莶草总黄酮的提取效果精密称取4份5.0g豨莶草药材粉末，分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)加入水，浸泡30min后，回流提取1h。重复提取两次，合并滤液，浓缩后，加50%的乙醇溶解定容至100mL，精密移取1.0mL，按“标准曲线的制备”项方法操作，测定吸光度值，结果如图3所示。随着料液比的增加，豨莶草总黄酮的含量先增多后减少，在料液比为1∶15时，豨莶草总黄酮含量最多，因此确定了料液比1∶15为豨莶草总黄酮提取的最佳比例。

3)提取时间对豨莶草总黄酮的提取效果精密称取6份5.0 g 豨莶草药材粉末，按料液比1∶15(g/mL)加入水，浸泡30min后，分别回流提取0.5、1、1.5、2、2.5、3h。重复提取两次，合并滤液，浓缩后，加50%的乙醇溶解定容至100mL，精密移取1.0mL，按“标准曲线的制备”项方法操作，测定吸光度值，结果如图4所示。回流提取1.5h时，豨莶草总黄酮含量最低。回流提取1、2、2.5h时，豨莶草总黄酮量差异无统计学意义，考虑到节约时间，提高效率，确定1h为最佳提取时间。

4)最佳提取条件下豨莶草总黄酮的含量测定精密称取6份5.0g豨莶草药材粉末，按料液比1∶15(g/mL)加入水，浸泡30min后，回流提取1h。重复提取两次，合并滤液，浓缩后，加50%的乙醇溶解定容至100mL，精密移取1.0mL，按“标准曲线的制备”项方法操作，测定吸光度值，结果如表2所示。豨莶草中总黄酮的含量为1.71%。

表2 最佳提取条件下豨莶草总黄酮的含量

3 结论

豨签草中主要化学成分包括二萜类、倍半萜类和黄酮类等化合物，其中关于总黄酮类化合物的提取和含量测定未见文献报道。Al(NO3)3络合法适用于豨莶草中总黄酮含量的测定，回收率95.9%～100.7%，平均回收率为 98.1%，相对标准偏差 1.7%，精密度高，重现性好，操作简便快速，可为控制该药材质量提供依据。

豨莶草中总黄酮的适宜提取工艺条件为：液料比 15∶1、水提、提取时间 1h，此条件下总黄酮得率为 1.71%。

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