pEGFP-N1-MeCP2上调质粒的构建及意义

罗军强

(荆门市第一人民医院神经外科，湖北 荆门 448000；荆门市五三医院外科，湖北 荆门 431821)

陈治军，刘平非，冯雨，谢腾

(荆门市第一人民医院神经外科，湖北 荆门 448000)

pEGFP-N1-MeCP2上调质粒的构建及意义

罗军强

(荆门市第一人民医院神经外科，湖北 荆门 448000；荆门市五三医院外科，湖北 荆门 431821)

陈治军，刘平非，冯雨，谢腾

(荆门市第一人民医院神经外科，湖北 荆门 448000)

目的：构建MeCP2真核表达载体并在SH-SY5Y细胞中表达。方法：采用RT-PCR、pEGFP-N1-MeCP2质粒提取、Western blot检测pEGFP-N1-MeCP2在在SH-SY5Y细胞中的表达。结果：将重组质粒pEGFP-N1-MeCP2与pEGFP-N1空载体组分别转染至SH-SY5Y细胞中，48h后利用Western Blot检测表明， 转染pEGFP-N1-MeCP2的细胞在82 kDa处可见一特异性的表达带，为MeCP2与GFP的融合蛋白，而在空载体组未见条带；在27KDa附近，空载体组可见条带，而转染pEGFP-N1-MeCP2的细胞未见条带，提示pEGFP-N1-MeCP2载体能够在SH-SY5Y细胞中表达。结论：构建pEGFP-N1-MeCP2上调质粒是进一步研究MeCP2蛋白功能的基础，也是研究MeCP2蛋白在帕金森病中作用机制的关键。

帕金森病；MeCP2；TH；SH-SY5Y细胞；6-OHDA

MeCP2在大多数组织中都有表达，但在大脑中表达最丰富。胞浆蛋白标准化的定量研究显示，肺和脾也是MeCP2表达丰富的组织[1]。直接定量测定成年小鼠每个细胞核中MeCP2分子，大脑神经元有16000000个，胶质细胞中较少，而肝细胞中少30倍[2]。小鼠神经元中MeCP2水平出生时相对较低，出生后3个月快速增加，随后达到平台期[2,3]。由于出生时神经形成已经完成，神经元在一个恒定数目范围内增加是由于MeCP2表达上调。而这个时候，这些神经元经历着活跃的突触发育。

鉴于MeCP2在大脑中可能作为大脑发育的调节因子或维持神经元/胶质功能的因子。我们的研究发现，MeCP2在帕金森病细胞模型中的表达下降，鉴于MeCP2在神经元中的作用，我们推测，MeCP2的表达下降可能参与了帕金森病的致病过程。因此，我们从人肺癌细胞cDNA文库中获得MeCP2基因，构建真核表达载体并在SH-SY5Y细胞中表达，为进一步研究MeCP2的功能打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞株购自美国America Type Culture Collection(ATCC)细胞库,人肺癌细胞A549，载体pEGFP-N1，感受态大肠杆菌DH 5α，D2000 plus DNA ladder、D2000 DNA ladder(Beijing Solarbio Science & Techology Co., LTD)，DNA聚合酶(TAKARA Bioiotechnology(Dalian) Co. ,LTD)，PstI(Fermentas Inc.)，XhoI(Fermentas Inc.)T4 DNA连接酶(Fermentas Inc.)，Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies)，TOYOBO First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace -α(TOYOBO CO,LTD)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen Biotech(Beijing) CO.,LTD)，10mM dNTPs(Fermentas Inc.)。一抗：MeCP2大鼠抗人抗单克隆抗体购 自美国Sigma公司，TH羊抗人抗单克隆抗体购自购自 Santa Cruz公司；Westem blot检测试剂盒购自上海晶美生物公司。二抗：兔抗鼠、鼠抗羊二抗均购自福州迈新生物技术开发公司。β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自美国Santa Cruz 公司。

1.2 方法

1)pEGFP-N1-MeCP2质粒构建 据MeCP2基因的CDC区设计引物及酶切位点：设计包含Pst I 和 Xho I (Promega USA)酶切位点的扩增MeCP2全长引物。上游引物5’ GCGCTCGAGGGTAAAAGCCGTCCGGAAAAT3’和下游引物5’CGGCTGCAGGCTAACTCTCTCGGTCACGGGC3’。其中包含下划线的为所含酶切位点。利用PCR扩增MeCP2编码序列，反应体系为50μL：10×PCR缓冲液5μL，dNTP 5μL、Taq酶 2.5μL、cDNA模板2μL，上下游引物(10μmol)各1.5μL。PCR反应条件：94℃ 2min、94℃ 10s、55℃ 30s、68℃ 80s，共32个循环；68℃延伸3min。68→94℃、30s→64℃、30s→72℃，4min(30次)末段延伸72℃、10min。将获得的PCR产物通过凝胶电泳明确扩增大小后，利用前述切胶回收方法纯化PCR产物。取PCR产物利用XhoⅠ和KpnⅠ酶双酶切，回收大片段，加T4连接酶16℃水浴过夜。连接产物转化感受态DH5a，将转化产物均匀涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB选择平板上倒置培养过夜。筛选2～3个菌落，摇菌后取1μL进行PCR扩增鉴定；小量提取质粒DNA，进行双酶切鉴定，将双酶切鉴定正确的质粒送华大基因测序。

2)pEGFP-N1-MeCP2质粒真核细胞表达的western blot检测鉴定 SH-SY5Y细胞转染pEGFP-N1-MeCP2质粒，提取总蛋白western blot表达鉴定。操作过程：蛋白样品提取；蛋白浓度测定；SDS-PAGE电泳；转膜，封闭；结合一抗，置于4℃摇床过夜；结合二抗，将抗体稀释液加入PVDF膜后置于摇床室温震摇1h；洗膜4次，每次5min,后利用PBS洗膜三次去除残存的Tween-20，利用ECL发光液暗室曝光显色并分析蛋白表达强弱。

2 结果

2.1 PCR扩增MeCP2 cDNA片段

通过PCR扩增的方法成功获得了MeCP2 cDNA片段，PCR的产物在l%琼脂糖凝胶上的分析，特异性片段的大小为1531bp。见图1。

2.2 重组质粒的鉴定结果

1)限制性内切酶酶切鉴定结果 用PstI和Xho I双酶切重组质粒pEGFP-N1-MeCP2得到与预期大小相符的外源基因插入片段，结果与PCR产物的大小1531bp比对相吻合，说明克隆成功。见图2。

图1 MeCP2 PCR产物琼脂糖电泳图 图2 pEGFP-N1-MeCP2 质粒酶切鉴定图

2)测序鉴定结果 将重组质粒重组质粒pEGFP-N1-MeCP2送去进行测序，比对与MeCP2的序列一致，说明插入的片段是正确的，克隆成功。

2.3 pEGFP-N1-MeCP2的表达鉴定结果

将重组质粒pEGFP-N1-MeCP2与pEGFP-N1空载体组分别转染至SH-SY5Y细胞中，48h后利用Western Blot检测表明， 转染pEGFP-N1-MeCP2的细胞在82 kDa处可见一特异性的表达带，为MeCP2与GFP的融合蛋白，而在空载体组未见条带；在27KDa附近，空载体组可见条带，而转染pEGFP-N1-MeCP2的细胞未见条带，提示pEGFP-N1-MeCP2载体能够在SH-SY5Y细胞中表达。见图3。

图3 重组质粒pEGFP-N1-MeCP2与pEGFP-N1空载体组分别转染至SH-SY5Y细胞中的表达鉴定

3 讨论

自从第一次发现MeCP2调节脑中特定区域基因的表达，包括正面的和负面的作用，以及独立活性依赖的调节[4,5]。目前，研究越来越多的集中于MeCP2的目标基因。发生于神经科学上MeCP2基因的缺失和过表达，发现的第一个与MeCP2相关的基因是脑源性神经营养因子(BDNF)。BDNF是一个生长因子，与神经元再生、神经元成熟、神经元功能维持及神经元存活、钙离子稳态、及突触可塑性方面发挥着重要作用，以及在学习、记忆、神经功能障碍中发挥重要作用[6]。

目前，脑内MeCP2与BDNF的机制尚不清楚[7,8]，但是MeCP2表达的高低却与BDNF紧密相关[9]。体外培养的小鼠皮质神经元中，过表达MeCP2提高了BDNF表达[10]，然而，因突变致MeCP2基因失去功能的小鼠，脑内BDNF表达降低[9]。MeCP2基因突变的小鼠，脑内BDNF恢复正常水平时，许多Rett综合征类似的生理学和行为缺陷症状得到了改善[11,12]。在培养神经细胞试验中发现，MeCP2与BDNF第三启动子结合抑制BDNF转录[4,13]。MeCP2基因突变的小鼠与野生型相比，BDNF蛋白表达和基因表达均下降了70%[14]。BDNF表达下降被认为造成了Rett综合征的病理过程。更重要的是，这些发现提示有些基因的活性受MeCP2调控。膜的去极化导致了MeCP2的磷酸化，引起目标基因启动子的释放，从而引起转录激活[4]。MeCP2基因敲除的小鼠，神经元活性受影响，研究MeCP2基因表达下降和其他基因表达提高之间的关系很困难。虽然MeCP2被广泛的认为是一个转录抑制因子，最近的研究显示，他可以与活性基因结合而调节基因表达[14～16]。

经证实，MeCP2可以抑制Dlx5、 Dlx6、Fxyd1、Reln和Gtl2的表达[17,18]。无MeCP2表达的小鼠，前额叶Dlx5、 Dlx6的转录作用明显加强[17]。在无MeCP2基因表达的小鼠和Rett综合征患者，前额叶Fxyd1表达明显较高[19]。在无MeCP2基因表达的小鼠和Rett综合征患者，BDNF、GABRB3和UBE3A的表达下降[20]。这些基因在调控神经发育阶段的树突结构和GABA能神经元功能方面发挥着重要作用。Dlx5和GABRB3是GABA能神经元发挥作用所必须的，前者调节合成GABA，后者则与GABA受体亚单位结合[20,21]。这些在额叶表达的基因与GABA能神经元的相互作用，证实了Rett综合征患者额叶GABA能神经元信号通路的功能紊乱[22]。然而，涉及到树突形态学改变的基因可以解释Rett综合征和无MeCP2基因表达小鼠树突修饰的原因。

Skirmantas Kriaucionis(2006)研究发现[23]，无MeCP2表达的小鼠脑组织中Uqcrc1过表达，Uqcrc1可以显著增加线粒体呼吸容量以及减少呼吸效率，过表达的Uqcrc1可导致N2A细胞(小鼠神经元细胞)线粒体呼吸功能的异常；他们通过电子显微镜(透射电镜)观察野生型和无MeCP2表达的小鼠脑组织没有发现线粒体总体结构的异常。体内实验显示MeCP2与Uqcrc1的启动子区结合，无MeCP2表达的小鼠，Uqcrc1表达提高以及导致神经学上的症状。在酶作用底物提供呼吸链复合体Ⅰ或呼吸链复合体Ⅱ，含有Uqcrc1蛋白的呼吸链复合体Ⅲ导致了异常的线粒体呼吸功能。Blue native electrophoresis 检测显示：MeCP2突变的小鼠，呼吸链复合体Ⅰ活性正常，提示呼吸链复合体Ⅰ没有提高异常的线粒体呼吸功能；这些研究显示，呼吸链复合体Ⅲ是增强线粒体呼吸功能的原因。在细胞系中，过表达的Uqcrc1与上游的呼吸链复合体Ⅳ酶作用底物促使线粒体呼吸速率提高。在Pavel(2009)的实验中[24]，MeCP2基因突变的小鼠，超微结构显示轴突和树突异常，以及异常扩展的线粒体和脊膜。JC Russell(2007)[25]首次发现，首次发现，在低氧和兴奋性毒性诱导干预的小脑颗粒神经元，MeCP2功能下降。完全MeCP2基因敲除小脑颗粒神经元较野生型死亡过程发生较早；在缺少MeCP2蛋白表达的CGC细胞与野生型的相比，神经元死亡明显较多，其过程是缺少MeCP2蛋白引起线粒体功能紊乱，线粒体释放caspase和AIF，从而启动神经元的凋亡。鉴于MeCP2基因灭活抑制基因的表达及其所致的转录紊乱，过表达的死亡复合体在中枢神经系统活性增加，使得神经元更容易受损以致死亡。

综上所述，MeCP2蛋白在神经元中有着很重要的生物学作用，并且与Rett综合症等相关疾病有着密切的联系；我们已经证实，MeCP2可能参与了帕金森病的发病过程。为了进一步研究MeCP2蛋白在帕金森病中的作用机制，本研究克隆得到了MeCP2的全长编码序列，并通过Western Blot检测表达的融合蛋白在SH-SY5Y细胞中的表达，为进一步研究其功能打下基础。

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2017-09-26

湖北省自然科学基金项目(2014CFB09)；湖北省荆门市科技计划项目(2013S01)；湖北省荆门市科技计划项目(2015S01)；荆门市重点科技计划项目(YFZD2016045)。

罗军强(1976-)，男，主治医师，主要从事神经退行性疾病的诊疗工作；通信作者：谢腾，44255018@qq.com。

[引著格式]罗军强，陈治军，刘平非，等. pEGFP-N1-MeCP2上调质粒的构建及意义[J].长江大学学报(自科版), 2017,14(24):48～52.

R34

A

1673-1409(2017)24-0048-05

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